Regulation of endolysosomal Two-Pore-Channel activity by the Calcium-Caffeine-Zinc sensitivity Protein (CCZ1)

Yang, Zhuo (2025): Regulation of endolysosomal Two-Pore-Channel activity by the Calcium-Caffeine-Zinc sensitivity Protein (CCZ1). Dissertation, LMU München: Fakultät für Chemie und Pharmazie

Abstract

TPC2 (Two-Pore Channel 2) is a cation channel passing Na+ and Ca2+ that is primarily localized on late endosomes and lysosomes. It is activated by the endogenous second messengers PI(3,5)P2 and NAADP, whose levels are modulated by various cellular stimuli. Dysregulation of TPC2 has been implicated in multiple disorders and pathological processes, including Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, non-alcoholic fatty liver disease and the migration of cancer cells. Both genetic ablation and pharmacological inhibition of TPC2 have demonstrated therapeutic benefits in disease models. So far, only a few proteins, including mTORC1, OCaR1 and Rab7a, have been shown to affect TPC2 activity. Moreover, it remains to be studied whether these proteins directly bind to the channel or affect channel activity via indirect pathways. This study aimed at identifying novel TPC2 regulatory proteins and delineating their contributions to TPC2-mediated pathological processes. Using various cancer cell lines, CRISPR-Cas9–mediated gene ablation, lysosomal patch-clamp recordings, FRET-based assays, and other techniques, Rab7a-mediated enhancement of TPC2 channel activity was confirmed, and a novel and essential role of CCZ1 in facilitating this interaction was uncovered. Notably, even constitutively active Rab7a[QL] failed to potentiate TPC2 activity in the absence of CCZ1, suggesting that CCZ1 has other impacts on TPC2 function rather than simply acting through Rab7a. Further characterization of TPC2 in CCZ1 deficient cells revealed markedly increased channel efficacy, a left-shifted EC50 for PI(3,5)P2, and the emergence of voltage dependence. Moreover, specific TPC2 activation by the synthetic TPC2 agonist TPC2-A1P elicited stronger migration and proliferation responses in CCZ1 knockout (KO) SK-MEL5 cells relative to wild-type (WT) cells, corroborating the increased sensitivity and maximal current response in the KO cells. Taken together, CCZ1 was identified as a novel regulatory protein for TPC2, whose loss significantly enhances TPC2 function and sensitivity to its agonists, thereby promoting more aggressive cancer cell migration and proliferation. These results advance the understanding of the complex regulatory landscape of TPC2 and suggest that targeting the TPC2–CCZ1 axis could offer new opportunities for therapeutic intervention in TPC2-related diseases.

Abstract

TPC2 (Two-Pore Channel 2) ist ein Na+ und Ca2+ permeabler Kationenkanal, der vorwiegend in späten Endosomen und Lysosomen lokalisiert ist. Er wird durch die endogenen second Messenger PI(3,5)P2 und NAADP aktiviert, deren zelluläre Konzentrationen durch verschiedene Stimuli reguliert werden. Eine Fehlregulation von TPC2 ist in mehrere Erkrankungen und pathologische Prozesse involviert, darunter die Alzheimer-Krankheit, die Parkinson-Krankheit, die nicht-alkoholische Fettlebererkrankung sowie die Migration von Krebszellen. Sowohl die genetische Inaktivierung als auch die pharmakologische Hemmung von TPC2 haben in murinen Krankheitsmodellen vielversprechende therapeutische Effekte gezeigt. Ob TPC2 über PI(3,5)P2 und NAADP hinaus von anderen zellulären Molekülen, insbesondere von Proteinen reguliert werden kann, ist weitgehend unerforscht. Bisher ist nur von wenigen Proteinen (z.B. mTORC1, OCaR1 und Rab7a) bekannt, dass sie die Aktivität von TPC2 beeinflussen. Es bleibt jedoch in den meisten Fällen offen, ob diese Regulation aus einer direkten Bindung an den Kanal resultiert oder indirekt vermittelt ist. In der vorliegenden Studie wurde das Ziel verfolgt, neue regulatorische Proteine von TPC2 zu identifizieren und deren Beitrag zu TPC2-vermittelten pathologischen Prozessen zu untersuchen. Mithilfe verschiedener Krebszelllinien, durch CRISPR-Cas9-vermittelte Gen-Ausschaltung, lysosomale Patch-Clamp-Messungen, FRET-basierte Assays und andere Methoden konnte die durch Rab7a vermittelte Verstärkung der TPC2-Kanalaktivität bestätigt werden und eine essenzielle Rolle von CCZ1 für diese Interaktion gezeigt werden. Bemerkenswerterweise konnte selbst die konstitutiv aktive Rab7a[QL] Mutante TPC2 Ströme nicht in Abwesenheit von CCZ1 verstärken, was darauf hindeutet, dass CCZ1 zusätzliche Auswirkung auf die TPC2-Funktion hat, anstatt ausschließlich über Rab7a zu wirken. Eine weiterführende Charakterisierung von TPC2 in CCZ1 defizienten Zellen zeigte eine deutlich gesteigerte Kanalaktivität, eine nach links verschobene EC50 für PI(3,5)P2 und das Auftreten einer Spannungsabhängigkeit. Darüber hinaus führte die spezifische Aktivierung von TPC2 durch den synthetischen TPC2 Agonisten A1P in CCZ1 Knockout (KO) SK-MEL5 Zellen zu stärkerer Migration und Proliferation im Vergleich zu Wildtyp-Zellen, was in Übereinstimmung mit einer erhöhten Sensitivität und maximale Stromantwort in den KO Zellen ist. Zusammenfassend wurde CCZ1 als ein neuartiges regulatorisches Protein für TPC2 identifiziert, dessen Verlust zu einer gesteigerten TPC2 Aktivität führt und die Empfindlichkeit des Kanals gegenüber seinen Agonisten signifikant erhöht. Dies führt in Tumorzelllinien zu einer verstärkten Zellmigration und Proliferation. Diese Ergebnisse erweitern das Verständnis der komplexen Regulierung von TPC2 und deuten darauf hin, dass eine therapeutische Beeinflussung der TPC2–CCZ1-Achse neue Möglichkeiten in der Behandlung TPC2-assoziierter Erkrankungen bieten könnte.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: TPC2, patch clamp, RAB7a, CCZ1-MON1-RMC1
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
• Fakultäten: Fakultät für Chemie und Pharmazie
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 16. September 2025
• 1. Bericht­erstatter:in: Biel, Martin