Generation of antibody-based therapeutics for treatment of acute leukemia

Schwach, Jonathan Meinrad (2025): Generation of antibody-based therapeutics for treatment of acute leukemia. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie

Abstract

Cancer has been a major focus of pharmaceutical research, yet this disease remains infamous for its highly challenging treatment. The main reason lies in the high heterogeneity not only due to the variety of cancer types but also due to the vast genomic and epigenomic diversity in the patients themselves. The success rates of common treatments such as chemotherapy strongly depend on the cancer type and clinical profile of the patient. Treatment can lead to adverse effects due to lack of specificity towards cancer cells. Thus, the aim of modern cancer therapy is the development of personalized treatment options that directly target cancerous tissue. Key challenges that need to be solved are the quick and reliable determination of differentially expressed proteins and cancerogenic mutations as well as the development of effective cancer-specific agents. Antibodies directly target cell surface structures such as overexpressed proteins and thereby offer a promising avenue for personalized cancer therapy. By combining specificity-conferring antibodies with other effector molecules, antibody drug conjugates employ the strengths of both moieties. However, the development of therapeutic antibodies and even more so antibody drug conjugates is a time-consuming and complicated process that starts with the identification and expression of suitable antigens, generation and characterization of binders, chemical conjugation, in vitro and in vivo characterization and concludes with the successful passing of clinical trials - a process which takes more than a decade for the development of a single therapeutic molecule. Due to these time constraints and the requirement for expertise from different fields, the work presented in this thesis contributes to collaborative projects at three different stages of the development of antibody therapeutics: First, we identify and characterize novel antibodies against overexpressed T cell antigens in acute lymphoblastic leukemia using hybridoma technology. We implement an optimized workflow to screen for binders that recognize surface-presented antigens, allowing for the future generation of antibody drug conjugates or chimeric antigen receptors. Second, to address the problem of profiling antigen-surface expression, we present a novel conjugation technique to generate nanobody oligonucleotide conjugates. Using a chemo enzymatic conjugation strategy based on enzymatic functionalization via tubulin-tyrosine ligase and click chemistry, we show that our method can effectively conjugate single stranded DNA and PNA to antibody fragments. We utilize confocal microscopy to demonstrate reversible hybridization of fluorescent, complimentary strands which in the future enables multiplexed detection of antigens by repeated cycles of hybridization, imaging and removal of the fluorescent strand. In addition, our conjugation technique could be used to generate antibody siRNA conjugates which are currently under investigation for therapeutic use by directly interfering with protein expression on the mRNA level. Lastly, we perform pre-clinical characterization of a Flt3-directed antibody drug conjugate to target cancer stem cells in acute myeloid leukemia. Cancer stem cells proliferate slowly and pose a challenging target to treat with commonly used anti proliferative drugs such as MMAF. To this end, we generated and thoroughly characterized humanized antibody variants of an Flt3 rat antibody using chromatography, ELISA, fluorescence microscopy and flow cytometry. In a collaborative effort duocarmycin was identified as a suitable payload for killing resting cells and improved in vitro activity of our antibody drug conjugate over the respective MMAF-conjugate against Flt3-positive cell lines and in a patient-derived xenograft model. Our data provides evidence that resting cells such as cancer stem cells can be efficiently targeted with a Flt3-targeting antibody drug conjugate conjugated to duocarmycin.

Abstract

Die Krebstherapie stellt bis heute einen Schwerpunkt der pharmazeutischen Forschung dar. Eine besondere Schwierigkeit ergibt sich bei der Behandlung von Krebs durch die hohe Heterogenität dieser Krankheit, die sich zum einen aus der großen Vielzahl an unterschiedlichen Krebstypen, zum anderen aus der hohen genomischen und epigenomischen Vielfalt der Patienten speist. Heutige Breitbandtherapien wie beispielsweise der Einsatz von Chemotherapeutika ermöglichen vielen Patienten eine Heilung oder zumindest eine zwischenzeitliche Reduktion der Tumorlast. Trotz vieler Erfolge existieren jedoch bis heute deutliche Defizite in der konventionellen Krebstherapie: Neben unzureichend anschlagenden Therapien entfaltet sich die Wirkung der Therapeutika im gesamten Körper anstatt nur an tumorösem Gewebe, was zu schweren Nebenwirkungen durch unspezifische Wechselwirkung mit gesunden Zellen führen kann. Daher ist und bleibt eine schnelle und zuverlässige Bestimmung des klinischen Profils wie beispielsweise der kanzerogenen Mutationen und überexprimierten Proteinen sowie die Entwicklung von effektiven und krebsspezifischen Therapeutika eine zentrale Herausforderung der modernen Krebstherapie. Antikörper stellen einen eleganten Ansatz der modernen, personalisierten Krebsmedizin dar. Sie sind in der Lage Oberflächenstrukturen wie beispielsweise überexprimierte Proteine auf Krebszellen zu erkennen und sind eine wichtige Molekülklasse für die Krebsdiagnostik und -therapie. Als eine Weiterentwicklung von therapeutischen Antikörpern haben sich Antikörper-Wirkstoffkonjugate etabliert. Diese neue Klasse von Therapeutika kombiniert die hohe Spezifität von Antikörpern mit weiteren Effektormolekülen und erlaubt einen völlig neuen Einsatz dieser Effektoren. Nichtsdestotrotz ist die Entwicklung solcher Antikörper-Wirkstoffkonjugate ein komplizierter und zeitintensiver Prozess, der von der Identifizierung und Herstellung von Antigenen über die Generierung und Charakterisierung von Bindemolekülen, der Konjugation zu einem Wirkstoff, der in vitro und in vivo Charakterisierung des Konjugats bis hin zum Abschluss der klinischen Phasen reicht. Für gewöhnlich dauert die Entwicklung eines einzigen Therapeutikums bis zur klinischen Zulassung über ein Jahrzehnt. Aufgrund dieser zeitlichen Einschränkungen und der benötigten Expertise aus unterschiedlichen Forschungsfeldern werden in dieser Arbeit Beiträge zu kollaborativen Projekten an drei unterschiedlichen Punkten der Therapeutikaentwicklung vorgelegt: Zum einen werden mittels Hybridomatechnologie Antikörper identifiziert und charakterisiert, die gegen überexprimierte Antigene auf T-Zellen gerichtet sind und zur Behandlung von akuter lymphoblastischer Leukämie eingesetzt werden können. Der Arbeitsablauf wurde dahingehend optimiert, Antikörper zu isolieren, die oberflächenexprimierte Antigene erkennen. Daher eignen sich die identifizierten Antikörper besonders zur Generierung von Antikörper-Wirkstoffkonjugaten oder chimären Antigenrezeptoren. Zweitens wird eine neue Konjugationsstrategie vorgestellt, die die Konjugation von Einzeldomänenantikörpern mit Oligonukleotiden ermöglicht und somit die Bestimmung von personalisierten Expressionsmarkern in Krebsgewebe erleichtert. Mittels einer chemoenzymatischen Konjugationsstrategie, welche eine enzymatische Ligationsreaktion der Tubulin-Tyrosinligase mit chemischer Click-Chemie kombiniert, konnten einzelsträngige DNA- und PNA-Moleküle an Antikörperfragmente konjugiert werden. Mit Hilfe von Konfokalmikroskopie konnte gezeigt werden, dass fluoreszierende Komplementärstränge reversibel an das Konjugat gebunden werden können, was zukünftig die Detektion einer Vielzahl an Zielstrukturen durch wiederholte Zyklen von Hybridisierung, Bildgebung und Entfernen des fluoreszenten Komplementärstranges ermöglicht. Ein neu aufkommender Therapieansatz ist der Einsatz von Antikörper-siRNA-Konjugaten, welche die direkte Manipulation von Proteinexpressionslevel auf Ebene der mRNA erlauben. Die hier vorgestellte Konjugationsstrategie könnte zusätzlich zur Herstellung von Antikörper-therapeutischen Oligonukleotidkonjugaten verwendet werden. Zuletzt fokussiert sich diese Arbeit auf die präklinische Charakterisierung eines gegen Flt3 gerichteten Antikörper-Wirkstoffkonjugats zur Abtötung von Krebsstammzellen in Akuter Myeloider Leukämie. Aufgrund ihrer geringen Teilungsrate zeigen Krebsstammzellen eine erhöhte Resistenz gegenüber üblichen antiproliferativen Wirkstoffen wie beispielsweise MMAF. Hierzu wurden humanisierte Varianten eines Flt3 Antikörpers, welcher aus der Ratte stammt, generiert und mittels Chromatographie, ELISA, Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometry charakterisiert. In Kollaboration mit anderen Arbeitsgruppen wurde Duocarmycin als Wirkstoff identifiziert, der im Vergleich mit etablierten Toxinen wie MMAF eine erhöhte Aktivität gegen sich langsam teilende Zellen wie beispielsweise Krebsstammzellen aufweist. Dieses Ergebnis konnte in in vitro Versuchen mit Flt3 positiven Zellen und in Xenograftmodellen mit Krebszellen demonstriert werden. Damit zeigt diese Arbeit auf, wie Krebsstammzellen und sich langsam teilende Krebszellen mit einem gegen Flt3 gerichteten Antikörper-Wirkstoffkonjugat abgetötet werden können.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: immunotherapy, antibody, antibody drug conjugates, leukemia, ALL, targeted therapy
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
• Fakultäten: Fakultät für Biologie
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 4. Februar 2025
• 1. Bericht­erstatter:in: Leonhardt, Heinrich