4D-Nanoparticle Tracking Combined with Real-Time Fluorescence Lifetime Imaging

Kellerer, Thomas (2025): 4D-Nanoparticle Tracking Combined with Real-Time Fluorescence Lifetime Imaging. Dissertation, LMU München: Fakultät für Physik

Abstract

Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) allows imaging of living cells while providing functional insights into local microenvironments, making it invaluable for studying structure-function relationships in biology. Lipid nanoparticle (LNP)-based nucleic acid delivery systems show great potential for curing genetic diseases and cancer. However, mechanisms of LNP uptake, transport, and cargo delivery remain poorly understood. Endosomal escape, closely linked to pH changes, is particularly elusive, as imaging fusion events at subcellular levels with high temporal resolution has yet to be achieved. Combining single-particle tracking (SPT) with environmental sensing, such as intracellular pH measurements, is crucial to gaining deeper insights. This thesis advances FLIM and SPT to address the needs of LNP studies in live-cell imaging, where current methods are mostly 2D and fail to integrate microenvironmental data. Two novel microscopy methods are introduced to overcome these limitations. The first enables particle tracking by modifying the point spread function of two-photon excited fluorescence microscopy (TPEFM). By introducing a spatial shift between two focal volumes of different wavelengths along the optical axis, it generates a spectral-signed error signal for centering the Z-position while tracking motion in the XY-plane. Using laser scanning, this approach provides real-time 2D diffraction-limited imaging with the particle always in the field of view. It also retains key TPEFM advantages, such as deep tissue penetration and reduced photobleaching. The second method accelerates FLIM with a digital lock-in amplifier, enabling real-time streaming of intensity-, lifetime-, and phasor data. This improves detection speed by a factor of 30 over state-of-the-art methods while preserving diffraction-limited resolution. It integrates seamlessly into laser-scanning microscopy systems and combines with other fluorescence methods, such as fluorescence correlation spectroscopy or the new tracking method. This combination allows for simultaneous tracking of a particle and its environment’s lifetime, previously unachievable with traditional single-particle tracking. These advancements allowed LNP pathways to be tracked in live-cell experiments at 7.6 fps with 1024x1024 pixel resolution, revealing distinct diffusion properties in the extracellular space, cell interior, and membrane. Static imaging over an hour showed mRNA-loaded LNP acidification, indicating transitions from early to late endosomes and degradation via lysosomes. These techniques highlight the potential of integrating fast fluorescence lifetime extraction with real-time particle tracking to advance LNP research.

Abstract

Die Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (FLIM) ermöglicht die bildgebende Darstellung lebender Zellen und liefert detaillierte Informationen über deren Mikroumgebung, was sie zu einem unverzichtbaren Werkzeug für die Untersuchung von topografischer Struktur und funktionaler Beziehungen in der Biologie macht. Nukleinsäure-Transportsysteme, die auf Lipid-Nanopartikel (LNP) basieren, besitzen großes Potenzial zur Behandlung genetischer Erkrankungen sowie Krebs. Die Mechanismen der LNP-Aufnahme, des Transports und der Freisetzung sind jedoch bisher kaum verstanden. Besonders die endosomale Freisetzung der Wirkstoffe, die eng mit Änderung des pH-Werts verbunden ist, bleibt auf subzellulärer Ebene mit der erforderlich hohen Detailtiefe in ihrem zeitlichen Ablauf unerforscht. Zur Klärung solcher Prozesse ist die Fähigkeit der Einzelpartikelverfolgung unter gleichzeitigen Messungen intrazellulärer Parameter wie dem pH-Wert entscheidend. Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, eine entsprechende Methodik weiterzuentwickeln, welche einzelne Partikel verfolgen und zusätzlich durch die Ermittlung der Fluoreszenz-Lebensdauer Informationen über deren Mikroumgebung ermitteln kann, um die Anforderungen der LNP-Forschung in der Lebendzell-Bildgebung zu unterstützen. Dabei werden zwei neuartige Mikroskopie-Methoden vorgestellt, welche bisher bestehende Einschränkungen überwinden. Die erste Methode modifiziert die Punktspreizung eines Zwei-Photonenmikroskops, indem sie eine räumliche Verschiebung zwischen Fokalvolumen unterschiedlicher Wellenlängen entlang der optischen Achse einführt. Dadurch entstehen drei Anregungsregionen, die somit ein Fehlersignal zur präzisen Verfolgung der Z-Position generieren. Dies ermöglicht die Echtzeit-Bildgebung mit hoher Auflösung. Die zweite Methode beschleunigt die Lebensdauermessung durch den Einsatz eines digitalen Lock-in-Verstärkers, der Echtzeitübertragungen von Intensitäts-, Lebenszeit- und Phasordaten ermöglicht. Dies steigert die Detektionsrate um den Faktor 30 gegenüber etablierten Methoden bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der optischen Auflösung. Diese Methode lässt sich nahtlos in Laserscanning-Mikroskope integrieren und mit anderen Techniken wie der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie kombinieren. Die Integration dieser Technik in den Tracking-Ansatz erlaubte die gleichzeitige Verfolgung eines Partikels sowie die Messung seiner Lebensdauer und seiner Umgebung, was bis dato ein Novum darstellt. Mit diesen Fortschritten konnten die Wege von einzelnen LNP-Partikeln in Lebendzell-Experimenten mit einer Geschwindigkeit von 7,6 Bildern pro Sekunde und einer Auflösung von 1024x1024 Pixeln verfolgt werden. Es wurden damit unterschiedliche Diffusionseigenschaften im extrazellulären Raum, Zellinneren und auf der Membran sichtbar gemacht. Das Ansäuern von mRNA-beladenen LNP zeigte Übergänge von frühen zu späten Endosomen und deren Abbau durch Lysosomen. Diese Ergebnisse zeigen eindrucksvoll das Potenzial der Integration von Fluoreszenzlebensdauermessungen und Echtzeit-Einzelpartikelverfolgung in der LNP-Forschung.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, Zwei-Photonen Mikroskopie, Lipid Nanopartikel, Transfektion, Tracking
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 530 Physik
• Fakultäten: Fakultät für Physik
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 11. Februar 2025
• 1. Bericht­erstatter:in: Rädler, Joachim