A prebiotic pathway to activate, polymerize and recycle ribonucleic acids

Langlais, Juliette (2024): A prebiotic pathway to activate, polymerize and recycle ribonucleic acids. Dissertation, LMU München: Fakultät für Physik

Abstract

Eine der wichtigsten Hypothesen für die Entstehung des Lebens auf der Erde ist, dass es aus einem System funktionalisierter RNA entstanden ist, das seine eigene Replikation katalysieren kann. Diese Ribozyme sind jedoch mindestens 50 Monomere lang, was die Frage aufwirft wie es abiotisch aus einem Pool von Nukleinsäuren de novo RNA-Stränge entstehen können, die lang genug sind, um aus demselben Pool von Nukleosiden/Tiden und einfachen Molekülen neue Stränge herzustellen? Es wurden mehrere Studien zu den verschiedenen Schritten durchgeführt, die zur Bildung der ersten Oligonukleotide führen konnten: Nukleotidsynthese, Phosphorylierung, Polymerisation, Ligation, Replikation, Selektion und Ribozymaktivität. Bis heute gibt es jedoch keinen Weg, auf dem alle diese Schritte unter denselben präbiotisch plausiblen Bedingungen effizient ablaufen. In dieser Arbeit wird ein Weg zur Bildung der ersten kurzen RNA-Stränge vorgestellt, der auf der Fähigkeit der 2′,3′-zyklischen Phosphatgruppe beruht, Diphosphoesterbindungen durch basenkatalysierte Transphosphoesterifikation unter milden, trockenen Bedingungen zu bilden. Im ersten Teil wurde die Polymerisation von 2′,3′-zyklischem Phosphatguanosin bei alkalischem pH-Wert in Gegenwart von Kaliumsalzen, ohne weiteren Katalysator und durch Trocknung bei 40°C beobachtet. Es konnten Oligomere von bis zu 10mere nachgewiesen werden, was einer Gesamtausbeute der Polymerisation von etwa 3 % entspricht. A, C und U zeigten eine deutlich geringere Effizienz bei der Oligomerisierung. Bei gemischten Proben wurde der Einbau der anderen Nukleobasen in die G-Oligomere nachgewiesen, aber die Produkte wurden weiterhin stark von G dominiert. Die Reaktion fand zusätzlich auch an einer Wasser- Luft-Grenzfläche statt, die einem Temperaturgradienten ausgesetzt war. In dieser aus dem Gleichgewicht geratenen Umgebung durchlaufen die Moleküle Feucht-Trocken-Zyklen, und die Produkte weisen eine etwas geringere Tendenz zu G auf. Im zweiten Teil wurde die gleiche Reaktion im manuellen Nass-Trocken-Verfahren bei Raumtemperatur durchgeführt. Diese Bedingungen verbessern die Polymerisationsausbeute für alle vier Nukleotide erheblich, insbesondere für A, C und U, für die 4-6mere nachgewiesen wurden. Der optimale Polymerisations-pH-Wert ist 10 für die Purinbasen G (70 %) und A (38 %) und 11 für die Pyrimidinbasen U (36 %) und C (39 %). Die Hydrolyse ist auch bei Raumtemperatur geringer, aber der Anteil an hydrolysierten Produkten nimmt mit höherer Zyklenzahl und höherem pH-Wert zu. Eine Tendenz zu G bleibt dennoch bestehen; Die Beobachtung des Trocknungsprozesses zeigt, dass die G-Monomere im getrockneten Zustand Flüssigkristalle und kristalline Phasen bilden. A, C und U bilden amorphe Phasen, obwohl für A einige kristalline Strukturen nachgewiesen werden konnten. Die Mischpolymerisation, die G einschließt, zeigt ausgeprägte amorphe und kristalline Phasen,die gemischten Produkte haben aber niedrige Konzentrationen, trotz einer ausgewogeneren Zusammensetzung bei pH 11. Der letzte Teil konzentrierte sich auf die Bildung der 2′,3′-zyklischen Phosphatgruppen unter Bedingungen, die mit der anschließenden Polymerisation vereinbar sind; Trocknung einer alkalischen Lösung bei niedriger Temperatur. Orthophosphat ist unter diesen Bedingungen eher unreaktiv, aber Trimetaphosphat erzeugt eine gewisse Menge an 2′,3′-zyklischen Phosphatprodukten durch Reaktion mit Nukleosid und 2′-/3′-Phosphat-Nukleotid bei alkalischen pH-Wert und einer Trocknungstemperatur von 60°C. Die Ausbeuten liegen unter 1%, aber einige Dimere können nachgewiesen werden. Die Anwesenheit anderer kleiner organischer Moleküle wie Harnstoff und Aminosäuren verbessert die Ausbeuten und beeinflusst die Regioselektivität der Reaktion. Die Phosphorylierung und Kondensation von Aminosäuren wird unter denselben Bedingungen beobachtet, was die parallele Bildung von RNA-Oligomeren und Peptiden plausibel macht.

Abstract

One of the most significant hypotheses for the emergence of life on Earth is that it started from a system of functionalized RNA able to catalyze its own replication. But those ribozymes are at least 50 monomers-long, which brings up the question: how to abiotically produce de novo RNA strands long enough from a pool of nucleosides/tides and simple molecules? Various works have been conducted on the different steps leading to the formation of the first oligonucleotides: nucleotide synthesis, phosphorylation, polymerization, ligation, replication, selection and ribozyme activity. But to this day, there is no pathway where all those steps are efficient in the same prebiotically-plausible conditions. This thesis presents a pathway to the formation of the first short RNA strands based on the ability of the 2′,3′-cyclic phosphate group to form diphosphoester bonds by base-catalyzed transphosphoesterification in mild, dry conditions. In the first part, the polymerization of 2′,3′-cyclic phosphate guanosine was observed at alkaline pH in presence of potassium salts, without any other catalyst, and by drying at 40 °C. Oligomers up to 10mers could be detected, for a total yield of polymerization of around 3 %. A, C and U showed a notably lesser efficiency toward oligomerization. In the case of mixed samples, incorporation of the other nucleobases in the G oligomers was detected, but the products remained heavily dominated by G. The reaction also occurred at a water-air interface submitted to a temperature gradient. In this local out-of-equilibrium environment, the molecules go through wet-dry cycling, and the products have a slightly lesser bias toward G. In the second part, the same reaction was conducted in manual wet-dry cycling at room temperature. The conditions improve considerably the polymerization yield for all four nucleotides, in particular A, C and U, for which 4-6mers were detected. The optimal polymerization pH is 10 for the purine bases G (70 %) and A (38 %), and 11 for the pyrimidine bases U (36 %) and C (39 %). Hydrolysis is also lower at room temperature, but the yield of hydrolyzed products still increases with higher numbers of cycles and pH value. A bias toward G remains: the observation of the drying process shows the G monomers form liquid crystals and crystalline phases in the dried state. A, C and U give amorphous phases although some crystalline structures could be detected for A. Mixed polymerization including G shows distinct amorphous and crystalline phases and the mixed products have low concentrations, in spite of a more balanced composition at pH 11. The final part focused on the formation of the 2′,3′-cyclic phosphate groups in conditions compatible with subsequent polymerization: drying of an alkaline solution at low temperature. Orthophosphate is rather unreactive in those conditions, but trimetaphosphate produces some amount of 2′,3′-cyclic phosphate products by reaction on nucleoside and 2′-/3′- phosphate nucleotide, at alkaline pH, for a drying temperature of 60 °C. The yields are below < 1 %, but some dimers are already detected. The presence of other small organic molecules like urea and amino acids improve the yields and impact the regioselectivity of the reaction. Amino acids phosphorylation and condensation are observed in the same conditions, which makes the parallel formation of RNA oligomers and peptides plausible.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Emergence of life, RNA world, 2′,3′-cyclic nucleotides, Polymerization, Phosphorylation
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 530 Physik
• Fakultäten: Fakultät für Physik
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 13. Dezember 2024
• 1. Bericht­erstatter:in: Braun, Dieter