Elucidating the molecular mechanisms of developmental timing in mammals

La Porte, Alexandra de (2024): Elucidating the molecular mechanisms of developmental timing in mammals. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie

Abstract

Embryonic development from a single cell to a fully grown organism in mammals adheres to a strict pattern, yet the speed of these events, the developmental timescale, is unique to each species and varies significantly. In this thesis, I explore the genetic, epigenetic, and extracellular factors orchestrating this transition. By leveraging in vitro models and single-cell sequencing techniques, I uncover the relationship between the properties of pluripotent stem cells (PSCs) and their developmental speed during neural differentiation, emphasizing the role of metabolic regulation in influencing differentiation potentials. I demonstrated a robust, universal system by cultivating PSCs from mouse, human, cynomolgus, and orangutans under harmonized conditions. In addition, I employed a uniform protocol to differentiate PSCs into neural progenitor cells (NPCs), highlighting nuanced differences in developmental speed among mouse, cynomolgus, and human. This standardization provided a ground for comparative studies, free from the interfering effects of extrinsic factors. Applying time-course single-cell multiome sequencing, I provided an in-depth view of transcriptional and chromatin changes during neural differentiation. This method revealed species-specific patterns, with mouse cells differentiating the fastest, followed by cynomolgus and human. Linear regression models showed that mouse cells differentiate approximately 2.4 times faster than human cells and 2.2 times faster than cynomolgus cells based on gene expression data. Single-cell ATAC sequencing data showed similar trends, with mouse cells differentiating 1.9 times faster than human cells and 1.7 times faster than cynomolgus cells. This analysis underscores how cells from different species resemble and differ in their differentiation trajectories. Through single-cell RNA sequencing analysis, I identified UGP2 as a gene upregulated in slower-differentiating species and slower-differentiating cells within one species. Deleting UGP2 in human and cynomolgus PSCs using CRISPR/Cas9 technology depleted cells of glycogen and accelerated neural differentiation, indicating its role in regulating metabolic rates by controlling glucose availability. In conclusion, my thesis enhances our understanding of the molecular mechanisms governing developmental speed across species, demonstrating the importance of UGP2 in regulating glycogen storage and influencing differentiation rates. This research lays the groundwork for future studies into species-specific developmental timing mechanisms, offering a robust framework for exploring developmental time scales across a broader array of species and developmental stages.

Abstract

Die Embryonalentwicklung von einer einzelnen Zelle zu einem ausgewachsenen Organismus verläuft bei Säugetieren nach einem strengen Muster, doch die Geschwindigkeit dieser Ereignisse, die Entwicklungszeitskala, ist bei jeder Art einzigartig und variiert erheblich untereinander. In dieser Arbeit untersuche ich die genetischen, epigenetischen und extrazellulären Faktoren, die diese Entwicklung steuern. Durch den Einsatz von In-vitro-Modellen und Einzelzellsequenzierungstechniken decke ich die entscheidenden Beziehungen zwischen den Eigenschaften pluripotenter Stammzellen (PSCs) und ihrer Entwicklungsgeschwindigkeit während der neuralen Differenzierung auf, wobei ich die Rolle der Stoffwechselregulation bei der Beeinflussung des Differenzierungspotenzials hervorhebe. Ich habe ein robustes, universelles System etabliert, indem ich PSCs von Maus, Mensch, Cynomolgus und Orang-Utan unter identischen Bedingungen kultiviert habe. Darüber hinaus verwendete ich ein einheitliches Protokoll zur Differenzierung von PSCs in neurale Vorläuferzellen (NPCs), wobei ich nuancierte Unterschiede in der Entwicklungs-geschwindigkeit zwischen Maus, Cynomolgus und Mensch herausstellte. Diese Standardisierung bot eine Grundlage für vergleichende Studien, die frei von eingreifenden Einflüssen äußerer Faktoren waren. Durch die Anwendung von Einzelzell-Multiom-Sequenzierung im Zeitverlauf konnte ich einen detaillierten Einblick in die Transkriptions- und Chromatinveränderungen während der neuralen Differenzierung gewinnen. Diese Methode hob artspezifische Muster hervor, wobei sich Zellen der Maus am schnellsten differenzieren, gefolgt von Cynomolgus und Mensch. Lineare Regressionsmodelle zeigten, dass sich Mauszellen auf der Grundlage von Genexpressionsdaten etwa 2,4-mal schneller differenzieren als menschliche Zellen und 2,2-mal schneller als Cynomolgus-Zellen. Einzelzell-ATAC-Sequenzierungsdaten zeigten ähnliche Trends, wobei sich Mauszellen 1,9-mal schneller differenzieren als menschliche Zellen und 1,7-mal schneller als Cynomolgus-Zellen. Diese Analyse unterstreicht, wie sich Zellen verschiedener Spezies in ihrem Differenzierungsverlauf gleichen und unterscheiden. Durch die Analyse der RNA-Sequenzierung einzelner Zellen konnte ich UGP2 als ein Gen identifizieren, das sowohl in langsamer differenzierenden Arten als auch in langsamer differenzierenden Zellen innerhalb einer Art hochreguliert ist. Durch die Deletion von UGP2 in menschlichen und Cynomolgus PSCs mit Hilfe der CRISPR/Cas9-Technologie wurde Glykogen von den Zellen nicht mehr gespeichert und die neurale Differenzierung beschleunigt, was darauf hindeutet, dass UGP2 eine Rolle bei der Regulierung der Stoffwechselrate durch die Kontrolle der Glukoseverfügbarkeit spielt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit unser Verständnis der molekularen Mechanismen, die die Entwicklungsgeschwindigkeit bei verschiedenen Spezies steuern, verbessert und die Bedeutung von UGP2 bei der Regulierung der Glykogenspeicherung und der Beeinflussung der Differenzierungsraten zeigt. Diese Forschung legt den Grundstein für künftige Studien über artspezifische Mechanismen der Entwicklungszeitskala und bietet einen robusten Rahmen für die Erforschung der Entwicklungszeitskala bei einer breiteren Palette von Arten und Entwicklungsstadien.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
• Fakultäten: Fakultät für Biologie
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 18. Dezember 2024
• 1. Bericht­erstatter:in: Enard, Wolfgang