New concepts for molecular photoswitches in chemical biology

Müller, Markus (2024): New concepts for molecular photoswitches in chemical biology: from molecular amplifiers in photoacoustic imaging to ideal efficacy switches for protein chromocontrol in tissues. Dissertation, LMU München: Fakultät für Chemie und Pharmazie

Abstract

This thesis comprises two parts with diverging research topics, that nevertheless share a common focus, on the interaction of light with a chromophore whose centrepiece is an N=N double bond. Part I: Contrast agents for photoacoustic imaging. Seeing is understanding, and imaging technologies are crucial to visualise biological processes at levels ranging from the (sub-)cellular to the whole body. Molecular imaging is the subfield that focuses on noninvasively imaging enzyme activity, usually by monitoring small molecular contrast agents that are designed to reveal specific biological processes. Photoacoustic (PA) imaging is a technical method that adds relatively new opportunities to the imaging toolbox. In PA, a pulsed laser is used as a precisely-resolved input, to excite chromophores that locally dissipate photon energy as heat, which induces pressure waves in the ultrasound frequency domain that serve as the output signal detected. PA using near infrared (NIR) lasers enables non-invasive bioimaging even at penetration depths of several cm, while delivering spatial resolution on the micron level. However, contrast agents suitable for molecular PA imaging are rare, and unified criteria to define how to design optimal contrast agents specifically for PA do not exist yet. The first part of this thesis addresses these deficits by providing a rational molecular blueprint for organic small molecule PA contrast agents that have three key features: they are loud (i.e. efficient conversion of photon energy to ultrasonic amplitudes), have high photostability (enabling long-term imaging experiments), and are NIR active (enabling deep tissue excitation). To achieve loudness and photostability, we aimed to create ultrafast-nonradiatively-relaxing molecular PA contrast agents. PA imaging uses laser pulses of typically just ~10 nanoseconds; with excited state lifetimes in the picosecond region (ca. 10 to 100-fold shorter than current dyes), PA contrast agents might undergo multiple excitation-relaxation cycles in each pulse, so harvesting more energy from each laser pulse, and amplifying the ultrasound signal output. Ultrafast relaxation should also suppress excited state side-reactions, thus photostabilising the chromophores. To achieve NIR activity in combination with these features, I merged azobenzene or azoheteroarene molecular switches with NIR-absorbing cyanine dyes, to obtain azohemicyanines (AzHCys) combining the NIR absorbance of the cyanine with the ultrafast relaxation of the molecular switches. AzHCys served as proof-of-concept compounds to validate the conceptual hypotheses. We confirmed the desired photophysical properties by spectroscopy and showed their amplified PA signal generation on a commercially available PA imaging device. We also showed that the often-formulated PA design goal of "low fluorescence quantum yield" is poorly-correlated to performance, and should be replaced by the considerations of relaxation rate and pathway that we demonstrate. Lastly, we applied the water soluble derivative wsT AzHCy in vivo with PA imaging by multispectral optoacoustic tomography (MSOT), and demonstrated it can be effectively unmixed (imaged) in tissue despite a non-ideal broadened absorption band (§1.3.2). The essence of this PA contrast agent design, demonstrated with AzHCys, is not dependent on a specific chemical space. Therefore, I consolidated the concept by translating it from molecular switches to molecular rotors. For this, I designed and synthesized NIR-absorbing ultrafast-relaxing triarylmethane (TAM) dyes, which were subsequently used for excited state spectroscopy and PA imaging: confirming the superior loudness of ultrafast relaxing chromophores, but on a chemically totally distinct motif (§1.3.3). Taken together, this research provides a photophysically guided molecular blueprint for loud and photostable PA contrast agents that can lead to the development of effective PA dyes that unlock the full potential of PA imaging. In particular, the second-generation TAM dyes are promising candidates for incremental improvements towards specific tasks, because their modular and straightforward synthesis facilitates the required chemical tuning steps, while retaining the overall beneficial PA properties. Part II: Photopharmacology tools for TRPC4/5 & efficacy photoswitches. TRPC4 and TRPC5 are proteins that are mainly expressed in the nervous system, that tetramerise to form ion channels with specific tissue-dependent functions. These functions were usually researched by genetic knockouts, and lately, by the application of selective pharmacological activators or inhibitors. However, ion channels are dynamic systems, and native signalling is not characterized by permanent activation or inhibition. Thus, dynamic pharmceuticals that can be spatiotemporally controlled are required for high-precision modulation; and light, as a non-invasive stimulus, is an ideal trigger for them. "Photopharmacological" ligands that include a light-responsive moiety such as reversibly photoswitchable azobenzenes can thus deliver spatiotemporal control, for example if the photoisomers differ in binding affinity (thus transferring a light-determined structural effect to the biological target). Indeed, several other TRP channels have been studied in detail by means of photopharmacology, but never TRPC4/5. TRPC4/5 share substantial structural overlap, and subtype-specific modulators are rare. One is the moderately potent TRPC5 agonist BTD. We created BTDAzo as a lit-active (Z-active) photoswitchable agonist with similarly good potency and selectivity as the parent compound BTD. BTDAzo enables excellent reversible activation of TRPC5, in overexpression cell culture model systems and in native tissue slices with endogenous expression levels. The selectivity over TRPC4 and suitable potency render BTDAzo a promising high-precision tool to study tissue-specific functions of TRPC5 (§2.3.2). A curious result arising from this work was that, in electrophysiology, BTDAzo all E→mostly Z photoswitching gave good channel activation, but then mostly Z→mostly E switching fully returned activity to basal channel activity, despite the incomplete photoisomerisation with significant residual active Z-isomer. We suggested that the two photoisomers would have to bind competitively, with either (1) opposing efficacy modes or else (2) with the E isomer being biologically innocent. We perceived that a second structural class of TRPC4/5 modulators, the highly potent xanthines, offered a rational route to install such an efficacy switch: because minor chemical modifications were known to alter efficacy from an agonist to an inhibitor. Therefore, we decided to rationally develop an efficacy photoswitch based on those high-potency lead structures by introducing azobenzenes as structural modifications exactly at the known chemical tipping points. We discovered AzPico and AzHC as nanomolar Z-isomer-agonists yet E-isomer-inhibitors, and by application in biological experiments, we could for perhaps the first time demonstrate the far-reaching implications of what we term ideal efficacy photoswitches as high-precision tools aiming at in vivo photopharmacology. Crucially, the photoinduced effect now correlates only with the ratio of isomers (instead of the concentration of the active isomer as for affinity photoswitches), so bioactivity photoswitching is independent of the concentration of the applied ligand. We argue this will uniquely enable photoswitching in complex tissue or in vivo because, despite inhomogeneous and time-dependent drug distributions, the effect is uniform due to the constancy of E/Z ratios established by any given light wavelength applied. With that in mind, we applied AzPico in cultured neurons, chromaffin cells, tissue slices, and lastly to excised organ sections (a deep tissue setting), where it reproducibly and photoreversibly controls TRPC4&5 function and downstream biology even at low endogenous expression levels. A highlight was demonstrating the photocontrol of macroscopic gut motions (similar to peristalsis) by photoswitching nanomolar applied concentrations of AzPico. Controlling the tonic force in an endogenously-mimicking way requires careful channel activity control, to avoid overstimulation of the muscle; and we show that efficacy switching can be harnessed by using reproducibly-oversaturating concentrations but tuned switching wavelengths to moderate TRPC4 activation, which mimics natural pathways better than by maximal channel activation (§2.3.3). Taken together, this research contributes to TRPC4/5 pharmacology with the introduction of potent, high-precision, and photoswitchable tool compounds suitable for progression to in vivo studies. Moreover, we aim to reinvigorate the field of photopharmacology by the detailed conceptual exploration and practical elucidation of the implications of ideal efficacy switches, as hitherto literature examples did not harness or consider the true power of efficacy switching.

Abstract

Diese Dissertation besteht aus zwei Teilen mit unterschiedlichen Forschungsthemen, wobei beide auf der Wechselwirkung von Licht und einem Chromophor mit einer N=N Doppelbindung aufbauen. Teil I: Kontrastmittel für die photoakustische Bildgebung. Bildgebung ist entscheidend, um biologische Prozesse von der (sub-)zellulären Ebene bis hin zum gesamten Körper zu visualisieren. Die molekulare Bildgebung ermöglicht nicht-invasive Bildgebung von Enzymaktivitäten, indem molekulare Kontrastmittel abgebildet werden, die spezifische biologische Prozesse aufklären sollen. Die photoakustische (PA) Bildgebung ist eine moderne Technologie die neue Möglichkeiten eröffnet, da bei PA ein gepulster Laser als präzise aufgelöster Input verwendet wird, der Chromophore anregt, die anschließend lokal Photonenergie als Wärme abgeben, was wiederum Druckwellen im Ultraschallfrequenzbereich erzeugt, die als Ausgangssignal detektiert werden. Die PA-Bildgebung mit Nahinfrarot-(NIR)-Lasern ermöglicht eine nicht-invasive Bildgebung bei Eindringtiefen von mehreren Zentimetern, während sie eine räumliche Auflösung auf Mikrometer-Ebene liefert. Allerdings sind Kontrastmittel, die für die molekulare PA-Bildgebung geeignet sind, selten, und es gibt noch keine einheitlichen Kriterien für die Entwicklung von PA-Kontrastmitteln. Der erste Teil dieser Dissertation beschäftigt sich mit diesen Defiziten, indem ein rationaler molekularer Bauplan für organische, kleine PA-Molekülkontrastmittel erarbeitet wird, der auf drei Aspekten beruht: Die Kontrastmittel sind laut (d.h. effiziente Umwandlung von Photonenergie in Ultraschall-Amplituden), haben eine hohe Photostabilität (was Langzeit-Bildgebungsexperimente ermöglicht) und sind NIR-aktiv (was eine Anregung in tiefem Gewebe ermöglicht). Um Lautstärke und Photostabilität zu erreichen, haben wir ultraschnell strahlungslos relaxierende molekulare PA-Kontrastmittel entwickelt. Die Laserpulse bei PA sind üblicherweise nur ca ~10 Nanosekunden lang und mittels angeregter Zustände mit Lebensdauern im Pikosekundenbereich (ca. 10- bis 100-mal kürzer als bei aktuellen Farbstoffen) könnten PA-Kontrastmittel mehrere Anregungs-Relaxations-Zyklen pro Puls durchlaufen, sodass mehr Energie aus jedem Laserpuls umgewandelt und das Ultraschallsignal verstärkt wird. Ultraschnelle Relaxation sollte auch Nebenreaktionen des angeregten Zustands unterdrücken und somit die Chromophore photostabilisieren. Um NIR-Aktivität in Kombination mit diesen Merkmalen zu erreichen, habe ich Azobenzol- oder Azoheteroaren-Molekularschalter mit NIR-absorbierenden Cyanin-Farbstoffen kombiniert, um Azohemicyanine (AzHCys) zu erhalten, die die NIR-Absorption des Cyanins mit der ultraschnellen Relaxation der Molekularschalter verbinden. AzHCys dienten als Modellverbindungen zur Validierung der konzeptionellen Hypothesen. Wir zeigten die gewünschten photophysikalischen Eigenschaften durch Spektroskopie und ihre verstärkte PA-Signalgenerierung auf einem kommerziell erhältlichen PA-Bildgebungsgerät. Außerdem zeigten wir, dass das oft formulierte PA-Kriterium einer "geringen Fluoreszenzquantenausbeute" keine Relevanz für die PA-Signalintensität hat und durch die von uns gezeigten Überlegungen hinsichtlich stralungsloser Relaxationsrate ersetzt werden sollte. Schließlich haben wir das wasserlösliche Derivat wsT-AzHCy für in vivo PA-Bildgebung durch multispektrale optoakustische Tomographie (MSOT) verwendet und konnten zeigen, dass trotz breiter Absorptionsbanden die spektrale Auftrennung in Gewebe effektiv funktioniert (§1.3.2). Das PA-Kontrastmittel-Design ist nicht auf eine bestimmte chemische Struktur beschränkt, daher habe ich das Konzept konsolidiert, indem ich es von molekularen Schaltern auf molekulare Rotoren übertragen habe. Dazu entwarf und synthetisierte ich NIR-absorbierende, ultraschnell relaxierende Triarylmethan (TAM)-Farbstoffe, die anschließend für Spektroskopie im angeregten Zustand und PA-Bildgebung verwendet wurden, und konnte erneut eine erhöhte Lautstärke ultraschnell relaxierender Chromophore mittels eines chemisch völlig anderen Motivs zeigen (§1.3.3). Zusammengefasst bietet diese Forschung einen photophysikalischen molekularen Bauplan für laute und photostabile PA-Kontrastmittel, die zur Entwicklung effektiver PA-Farbstoffe führen können und somit das volle Potenzial der PA-Bildgebung eröffnen. Insbesondere die TAM-Farbstoffe der zweiten Generation sind vielversprechende Kandidaten für schrittweise Verbesserungen in Richtung spezifischer Aufgaben, da ihre modulare und unkomplizierte Synthese die erforderlichen chemischen Modifikationen erleichtert, während die insgesamt vorteilhaften PA-Eigenschaften beibehalten werden. Teil II: Photopharmakologische Werkzeuge für TRPC4/5 und Wirksamkeitsphotoschalter. TRPC4 und TRPC5 sind Proteine, die hauptsächlich im Nervensystem exprimiert werden und als Tetramere Ionenkanäle mit spezifischen, gewebsabhängigen Funktionen bilden. Diese Funktionen wurden bisher vorwiegend durch genetische Knockouts erforscht oder in letzter Zeit durch die Anwendung selektiver pharmakologischer Aktivatoren oder Inhibitoren. Allerdings sind Ionenkanäle dynamische Systeme, und die native Signalübertragung ist nicht durch eine permanente Aktivierung oder Inhibition gekennzeichnet. Daher werden dynamische Modulatoren benötigt, die räumlich und zeitlich kontrolliert werden können, um eine hochpräzise Modulation zu ermöglichen. Dabei ist Licht, als nicht-invasiver Impuls, ein idealer Auslöser für solche Wirkstoffe. „Photopharmakologische“ Liganden, die eine lichtempfindliche Komponente wie reversibel photoschaltbare Azobenzole enthalten, können eine räumlich-zeitliche Kontrolle bieten, insbesondere wenn sich die Photoisomere in ihrer Bindungsaffinität unterscheiden (und so einen lichtbestimmten Struktureffekt auf das biologische Ziel übertragen). Tatsächlich wurden mehrere andere TRP-Kanäle detailliert mittels Photopharmakologie untersucht, TRPC4/5 jedoch noch nicht. TRPC4/5 sind strukturell sehr ähnlich und subtypspezifische Modulatoren sind selten. Einer davon ist der mäßig potente TRPC5-Agonist BTD. Wir entwickelten BTDAzo als lichtaktiven (Z-aktiven) photoschaltbaren Agonisten mit ähnlich guter Potenz und Selektivität wie die Ausgangsverbindung BTD. BTDAzo ermöglicht eine hervorragende reversible Aktivierung von TRPC5 in Überexpressionszellkulturmodellen und in nativen Gewebeschnitten mit endogenen Expressionsniveaus. Die Selektivität gegenüber TRPC4 und die geeignete Potenz machen BTDAzo zu einem vielversprechenden Präzisionswerkzeug zur Erforschung gewebespezifischer Funktionen von TRPC5 (§2.3.2). Ein interessantes Ergebnis dieser Arbeit war, dass in der Elektrophysiologie das Schalten von BTDAzo von "komplett E" zu "überwiegend Z" eine gute Kanalaktivierung bewirkte, aber das Schalten von "überwiegend Z" zu "überwiegend E" die Aktivität vollständig auf die basale Kanalaktivität absenkte, trotz unvollständiger Photoisomerisierung und signifikantem Rest des aktiven Z-Isomers. Wir nehmen an, dass die beiden Photoisomere kompetitiv binden müssen, und zwar entweder (1) mit entgegengesetzten Wirksamkeiten oder (2) das E-Isomer ist biologisch harmlos. Wir erkannten, dass eine zweite strukturelle Klasse von TRPC4/5-Modulatoren, die hochpotenten Xanthine, einen rationalen Ansatz zur Entwicklung eines Wirksamkeitsschalters bietet, da bekannt ist, dass geringfügige chemische Modifikationen die Wirksamkeit von einem Agonisten zu einem Inhibitor verändern können. Deshalb beschlossen wir, einen Wirksamkeitsphotoschalter auf Basis dieser hochpotenten Leitstrukturen zu entwickeln, indem wir Azobenzole als strukturelle Modifikationen genau an den bekannten chemischen Kipp-Punkten einführten. Wir entdeckten AzPico und AzHC als nanomolare Z-Isomer-Agonisten, jedoch E-Isomer-Inhibitoren, und konnten in biologischen Experimenten erstmals die weitreichenden Implikationen demonstrieren. Entscheidend ist, dass der photoinduzierte Effekt nun nur mit dem Verhältnis der Isomere korreliert (anstatt mit der Konzentration des aktiven Isomers wie bei Affinitäts-Photoschaltern), sodass die Bioaktivität unabhängig von der Konzentration des verabreichten Liganden geschaltet werden kann. Wir denken, dass dies auf einzigartige Weise die Schaltbarkeit in komplexem Gewebe oder in vivo ermöglicht, da trotz inhomogener und zeitabhängiger Wirkstoffverteilungen der Effekt aufgrund der Konstanz der E/Z-Verhältnisse bei jeder angewendeten Lichtwellenlänge einheitlich bleibt. Mit diesem Ansatz verwendeten wir AzPico in kultivierten Neuronen, chromaffinen Zellen, Gewebeschnitten und schließlich in exzidierten Organabschnitten (tiefes Gewebe), wo es reproduzierbar und photoreversibel die Funktion von TRPC4/5 und nachgeschaltete Prozesse auch bei niedrigen endogenen Expressionsniveaus steuert. Ein Höhepunkt war der Nachweis der Photokontrolle makroskopischer Darmbewegungen (ähnlich der Peristaltik) durch das Photoschalten nanomolarer Konzentrationen von AzPico. Die Kontrolle der tonischen Muskelkraft in einer endogen nachgeahmten Weise erfordert eine sorgfältige Steuerung der Kanalaktivität, um eine Überstimulation des Muskels zu vermeiden und wir zeigen, dass der Wirksamkeitsschalter mit eigentlich übersättigender Konzentrationen mittels Schaltwellenlängen nivelliert werden kann, um schließlich TRPC4-Aktivierung zu moderieren. Diese Nivellierung imitiert die natürlichen Signalwege deutlich besser als eine maximale Kanalaktivierung (§2.3.3). Zusammengefasst trägt diese Forschung zur TRPC4/5-Pharmakologie bei, indem potente, hochpräzise und photoschaltbare Werkzeugverbindungen eingeführt werden, die für die Weiterentwicklung zu in vivo Studien geeignet sind. Darüber hinaus zielt unsere Arbeit darauf ab, das Feld der Photopharmakologie aufzurütteln, indem wir die Implikationen idealer Wirksamkeitsschalter konzeptionell detailliert untersuchen und praktisch aufzeigen, da bisherige Literaturbeispiele die tatsächlichen Möglichkeiten von Wirksamkeitsschaltern nicht genutzt oder berücksichtigt haben.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Photopharmacology, Chromocontrol, TRPC4/5, Photoacoustic Imaging
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
• Fakultäten: Fakultät für Chemie und Pharmazie
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 6. Dezember 2024
• 1. Bericht­erstatter:in: Thorn-Seshold, Oliver