Towards spatial proteomics at single protein resolution

Unterauer, Eduard (2024): Towards spatial proteomics at single protein resolution. Dissertation, LMU München: Fakultät für Physik

Abstract

The fundamental goal of life science research is the understanding of living systems in their full complexity. Spatial omics technologies try to answer this question by providing comprehensive spatial maps, localizing all biomolecules of a given system. Ultimately, this means mapping of tens or even hundreds of thousands of interaction partners at molecular resolution. To achieve this task of "localizomics", many technologies have been proposed. Multiplexed error-robust FISH (MERFISH) and sequential fluorescence in situ hybridization (seqFISH+) are the leading technologies in mapping transcriptomic and genomic arrangement, visualizing thousands of transcripts and loci on an organ scale. Imaging mass cytometry (IMC), multiplexed ion beam imaging (MIBI) and co-detection by indexing (CODEX) provide proteome maps with up to 60 targets resolved. But while all these technologies can map high numbers of biomolecules, none of them is capable of achieving nanoscopic resolution. Super-resolution microscopy methods are capable of revealing protein arrangements with nanometer resolution, but are commonly limited to the detection of a handful of biomolecules. Even approaches like DNA-PAINT, which can achieve unlimited multiplexing with approaches like Exchange-PAINT, lack either the throughput (in traditional DNA-PAINT) or the multiplexing power (in speed-optimized DNA-PAINT) to achieve more than the arrangement of six protein targets even in single cells. The work in this thesis is aimed to break these limitations and enable super- resolution microscopy as a tool for spatial omics. By the development of secondary label-based unlimited multiplexed DNA-PAINT (SUM-PAINT), the mapping of protein distributions of single cells with molecular resolution can be achieved in minutes with unlimited multiplexing power. This technology was applied to map a 30 protein, 3D neuronal atlas at single protein resolution, providing a comprehensive study at the nanoscopic arrangement of neuronal architecture and synapse heterogeneity. The complexity of the data necessitated the development of a machine learning-based analysis pipeline for exploratory investigation, which ultimately led to the discovery of a new class of chemical synapses. This synapse, which was termed "mixed", is characterized by the juxtaposition of an inhibitory specific postsynaptic scaffold (Gephyrin) and an excitatory specific presynaptic neurotransmitter transporter (VG- lut1). The second part of this work focused on the translation of the SUM-PAINT technology, by providing a detailed protocol, outlining the entire process of experimental design and difficulties to apply SUM-PAINT on any biological system of interest. In the final part of this thesis left-handed DNA is used to provide an easier approach to spatial proteomic imaging, without the use of secondary-labels. This technology is boosting the imaging throughout by a factor of 2, but is limited to the detection of 12 targets. Lastly, open biological questions and new promising technologies are addressed paving the way to super-resolved localizomics.

Abstract

Das grundlegende Ziel der Lebenswissenschaften ist das Verstaendnis von Organismen in ihrer gesamten Komplexitaet. Raeumliche Omic Technologien versuchen diese Frage zu beantworten, indem sie umfassende raeumliche Karten liefern, welche alle Biomolekuele eines gegebenen Systems lokalisieren. Dies bedeutet die Kartierung von Zehn- oder sogar Hunderttausenden von Interaktionspartnern mit molekularer Aufloesung. Um diese Aufgabe, welche „Localizomik“ genannt wird, zu erfuellen, wurden mehrere Technologien implementiert. Multiplexed error-robust FISH (MERFISH) und sequential fluorescence in situ hybridization (seqFISH+) sind die fuehrenden Technologien bei der Kartierung der transkriptomischen und genomischen Verteilungen, und in der Lage Tausende von mRNA und DNA-Abschnitte auf Organebene zu visualisieren. Imaging mass cytometry (IMC), multiplexed ion beam imaging (MIBI) und co-detection by indexing (CODEX) sind in der Lage Proteomeverteilungen mit bis zu 60 aufgeloesten Zielen bereitzustellen. Mit all diesen Technologien kann zwar eine grosse Anzahl von Biomolekuelen kartiert werden, aber keine von ihnen ist in der Lage, eine nanoskopische Aufloesung zu erreichen. Superaufloesungsmikroskopie kann Proteinanordnungen mit Nanometeraufloesung kartieren, diese Verfahren sind aber in der Regel auf wenige Biomolekuele beschraenkt. Selbst Verfahren wie DNA-PAINT, welche mit Technologien wie Exchange-PAINT unbegrenzte Anzahl an verschiedenen Zielen aufloesen koennen, verfuegen entweder nicht ueber den Durchsatz (bei traditionellem DNA-PAINT), oder nicht ueber die Faehigkeit mehr als sechs verschiedene Ziele (bei geschwindigkeitsoptimiertem DNA-PAINT) in einzelnen Zellen aufzuloesen. Die Arbeit in dieser Dissertation hat als Ziel diese Beschraenkungen zu ueberwinden und die superaufloesende Mikroskopie als Werkzeug fuer raeumliche Omic zu ermoeglichen. Durch die Entwicklung der Technologie secondary label-based unlimited multiplexed DNA-PAINT (SUM-PAINT) kann die Kartierung von Proteinverteilungen einzelner Zellen mit molekularer Aufloesung innerhalb von Minuten mit unbegrenzter Anzahl an verschiedenen Zielen erreicht werden. Als Anwedung dieser Technologie wurde ein neuronaler 3D-Atlas mit 30 Proteinen in Einzelproteinaufloesung kartiert, was eine umfassende Untersuchung der nanoskopischen Anordnung der neuronalen Architektur und der synaptischen Heterogenitaet ermoeglicht. Die Komplexitaet der Daten erforderte die Entwicklung einer auf maschinellem Lernen basierenden Analyse welche uneingenommene entdeckerische Untersuchungen ermoeglicht, die schliesslich zur Entdeckung einer neuen Klasse von chemischen Synapsen fuehrte. Diese Synapse, welche wir als „gemischt“ bezeichneten, ist gekennzeichnet durch die nebeneinanderliegende Anordnung des fuer inhibitorische Synapsen spezifischen postsynaptischen Geruests (Gephyrin) und des fuer excitatorische Synapsen spezifischen presynaptischen Neurotransmittertransporters (VGlut1). Der zweite Teil dieser Arbeit konzentrierte sich auf die Verbreitung der SUM-PAINT-Technologie, indem ein detailliertes Protokoll erstellt wurde, welches den gesamten Prozess der Versuchsplanung und die Schwierigkeiten bei der Anwendung von SUM-PAINT auf beliebige biologisches System darlegt. Im letzten Teil dieser Arbeit wird linkshaendige DNA verwendet, um einen einfacheren Ansatz fuer die raeumliche Proteomic, ohne die Verwendung von Sekundaeren Markern zu ermoeglichen. Diese Technologie steigert die Bildgebungsgeschwindigkeit um den Faktor 2, ist aber auf den Nachweis von 12 Zielen beschraenkt. Abschliessend werden offene biologische Fragen und neue vielversprechende Technologien besprochen, die den Weg zur Lokalizomik ebnen.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 530 Physik
• Fakultäten: Fakultät für Physik
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 12. November 2024
• 1. Bericht­erstatter:in: Jungmann, Ralf