Label-free monitoring of photolipid bilayer isomerization with single gold nanoprobes

Zhang, Jinhua (2024): Label-free monitoring of photolipid bilayer isomerization with single gold nanoprobes = Markerlose Überwachung der Isomerisierung von Photolipiddoppelschichten durch Einzelne Gold-Nanosonden. Dissertation, LMU München: Fakultät für Physik

Abstract

The photolipid azo-PC is a photoswitchable derivative of phosphatidylcholine, containing an azobenzene group in one of its lipid tails. It can be reversibly switched between its trans- and cis-isomeric forms by illumination with ultraviolet (UV) and blue light, respectively. When azo-PC is integrated into synthetic lipid bilayer membranes or biological (cell-) membranes, it is possible to control specific lipid membrane properties such as bending rigidity, fluidity, permeability, membrane fusion, and the formation of lipid domains by optical switching of its conformation. Fluorescence microscopy is widely used to investigate these physical properties of lipid bilayer systems, i.e. of liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). However, the interaction between fluorescent molecules and azobenzene-modified photolipids in a bilayer assembly remains largely unexplored. Strong effects are expected, as azobenzenes have been reported as efficient fluorescence quencher in solution or in polymer systems. One aim of this work was to investigate the influence of fluorescence-labeled lipids on the photo-physics and isomerization behavior of azo-PC in lipid bilayer membranes. In particular, it was analyzed how doping of photolipid membranes with fluorescently labelled lipids that are excited in the red region of the visible spectrum, such as Rhodamine, can accelerate the cis-to-trans switching rate of azo-PC by several orders of magnitude. Red light in particular is favorable for biological applications of photolipids because it penetrates deeper into tissue than light with shorter wavelengths. Therefore, the demonstrated ability to photosensitize azo-PC isomerization with fluorescent dyes opens up new perspectives for the use of photoswitches in biological systems. At the same time, the switching of azo-PC photolipids also leads to a modulation of dye emission. The dependence of fluorescence quenching on photolipid concentration and conformation was also characterized for different fluorophores, revealing significantly more efficient quenching for the cis compared to the trans isomer. The strong interactions between fluorescent dyes and azobenzene-based photolipids emphasize the need for the development of label-free methods to study switching behavior in photolipid membranes in real time. In this work, two complementary methods were developed and characterized. The first approach is based on the investigation of photoswitchable SLB membranes using plasmonic sensors. For this purpose, Gold nanorods (AuNRs) adsorbed on a glass substrate were coated with a supported photolipid bilayer. The molecules were switched between trans and cis by alternating irradiation with UV and blue light using light-emitting diodes (LEDs). The light-driven changes in membrane properties, associated with changes in membrane thickness, -density, and the conformational changes of the azobenzene lipid tails, lead to alterations in the dielectric environment of the nanoparticles and, consequently, to a measurable shift in the plasmon resonance frequency. The applicability of this approach for analyzing membrane photoisomerization and fluidity was demonstrated through time-dependent measurements of scattering spectra from individual nanorods. Secondly, an approach to conduct surface enhanced Raman scattering (SERS) spectroscopy of photolipids bilayers on gold nanoellipsoids was developed. The advantage of Raman spectroscopy compared to plasmonic sensing lies in the fact that the SERS spectra contain information about the chemical nature and, therefore, the conformation of azo-PC within the bilayer. To develop a single-particle SERS platform, a method was devised to print AuNRs onto a glass substrate by combining optical forces and plasmonic heating. It was observed that at a certain laser intensity, controlled deformation of the nanorods into nanoellipsoids could be achieved. These ellipsoids exhibit sharper tips at the particle ends, resulting in increased electromagnetic field enhancement, enabling SERS measurements of the switching behavior of photolipids in a bilayer.

Abstract

Das Photolipid azo-PC ist ein photoschaltbares Derivat von Phosphatidylcholin, das eine Azobenzolgruppe in einem seiner Lipidschwänze enthält. Es kann durch Beleuchtung mit ultraviolettem (UV) und blauem Licht reversibel zwischen seiner trans- und cis-isomeren Form geschaltet werden. Wenn azo-PC in synthetische Lipidmembranen oder Zellmembranen integriert wird, ist es möglich, durch das optische Schalten der azo-PC-Konformation spezielle Lipidmembraneigenschaften wie beispielsweise die Biegesteifigkeit, Fluidität, Permeabilität, Membranfusion und die Bildung von Lipiddomänen mit Licht zu steuern. Zur Untersuchung dieser physikalischen Eigenschaften von Lipidsystemen kommt häufig die Fluoreszenzmikroskopie zum Einsatz. Dabei ist die mögliche Wechselwirkung zwischen fluoreszierenden Molekülen und der Photoisomerisierung von azobenzol-modifizierten Lipiden in Membranen von Vesikeln oder oberflächengebundenen Lipidmembranen bisher weitestgehend unerforscht. Starke Effekte sind jedoch zu erwarten, da Azobenzol häufig als Fluoreszenzquencher in Lösung und in Polymersystemen zum Einsatz kommt. Ein Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von fluoreszenzmarkierten Lipiden auf die Photophysik von azo-PC in Lipidmembransystemen zu untersuchen. Dabei konnte insbesondere gezeigt werden, dass durch die Dotierung von Photolipidmembranen mit Fluoreszenzfarbstoffen, die im roten Bereich des sichtbaren Spektrums angeregt werden, wie beispielsweise Rhodamin, die cis-zu-trans-Schaltrate von azo-PC in diesem Wellenlängenbereich um mehrere Größenordnungen beschleunigt werden kann. Rotes Licht ist für biologische Anwendungen besonders geeignet, da es eine größere Eindringtiefe in Gewebe hat als Licht mit kürzeren Wellenlängen. Die Möglichkeit, Azobenol-lipide mithilfe von Fluoreszenzfarbstoffen zu photosensibilisieren, eröffnet daher neue Perspektiven für den Einsatz von Photoschaltern in biologischen Systemen. Gleichzeitig führt die Wechselwirkung der azo-PC auch zu einer Modulation der Farbstoffemission. Die Fluoreszenzlöschung für verschiedene Fluorophore in Abhängigkeit von der Photolipidkonzentration und -konformation wurde ebenfalls charakterisiert, und es wurde eine deutlich effizientere Fluoreszenzlöschung für die cis-Isomere im Vergleich zur trans-Form festgestellt. Die starken Wechselwirkungen zwischen Fluoreszenzfarbstoffen und azobenzol-basierten Photolipiden begründen die Notwendigkeit der Entwicklung markierungsfreier Methoden zur Untersuchung des Schaltverhaltens in Photolipidmembranen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei komplementäre Methoden entwickelt um dieses Ziel zu erreichen. Die erste Methode basiert auf der Untersuchung photoschaltbarer, oberflächengebundener Lipidmembranen mittels plasmonischer Sensoren. Dazu wurden Gold-Nanostäbchen auf einem Glassubstrat mit einer Photolipid-Doppelschicht bedeckt, deren Moleküle durch wechselnde Beleuchtung mit UV und blauem Licht zwischen der trans- und cis-Form geschaltet wurden. Die lichtgesteuerte Veränderung der Membraneigenschaften, insbesondere die Veränderung der Membrandicke, -dichte und die Konformationsänderung der Azobenzol-Gruppe, führt zu einer Veränderung der dielektrischen Umgebung der Nanopartikel und damit zu einer Verschiebung der Plasmonresonanzfrequenz. Die Anwendung dieses Verfahrens zur Messung des Membranschaltdynamik und zur Analyse der Membranfluidität konnte mittels zeitabhängiger Messungen der Streuspektren an einzelnen Nanostäbchen gezeigt werden. Als zweites Verfahren wurde die Möglichkeit der oberflächenverstärkten Raman-Streuung (surface enhanced Raman scattering, SERS) von Photolipiden auf Gold-Nanoellipsoiden untersucht. Der Vorteil der Raman-Spektroskopie im Vergleich zur plasmonischen Sensorik liegt darin, dass in den Spektren auch Informationen über die chemische Struktur der azo-PCIsomere enthalten sind. Zur Entwicklung einer Einzelpartikel-SERS-Plattform wurde eine Methode entwickelt, um Gold-Nanostäbchen durch die Kombination von optischen Kräften und plasmonischem Heizen auf ein Glassubstrat zu drucken. Dabei wurde beobachtet, dass bei einer bestimmten Laserintensität die kontrollierte Verformung der Nanostäbchen zu Nanoellipsoiden erzielt werden kann. Diese Ellipsoide zeigen schärfere Spitzen an den Partikelenden und dadurch eine erhöhte elektromagnetische Feldverstärkung, die SERS-Messungen der Schaltvorgänge von Photolipiden in einer Lipidmembran ermöglicht.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: photoswitchable lipid, photosensitized isomerization, fluorescence modulation, plasmonic sensing, surface enhanced Raman scattering
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 530 Physik
• Fakultäten: Fakultät für Physik
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 25. November 2024
• 1. Bericht­erstatter:in: Lohmüller, Theobald