Functional dissection of the two domains of Tim50, the main receptor of the TIM23 complex

Genge, Marcel Gilbert (2024): Functional dissection of the two domains of Tim50, the main receptor of the TIM23 complex. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie

Abstract

Mitochondria, though commonly known as ‘powerhouses of the cell’, are not only involved in the energy production but rather represent a central biosynthetic and signalling hub for many essential cellular processes, ranging from metabolite synthesis and degradation to apoptosis. Even though mitochondria possess their own genome, this genome only encodes for a very limited number of proteins and therefore mitochondrial biogenesis requires import of over 1000 different nuclearencoded proteins from the cytosol. The vast majority of these proteins carry cleavable, N-terminal presequences that target proteins to the mitochondrial matrix in a process mediated by two highly specific protein translocases, the TOM and TIM23 complexes in the outer and inner membranes, respectively. Several components of the TOM and TIM23 complexes form an intricate network of protein–protein interactions in the intermembrane space (IMS) that coordinates transfer of precursor proteins from the outer to the inner mitochondrial membrane. Through interactions with incoming precursor proteins and multiple subunits of both translocases, Tim50 is the central player in this network and as the major receptor subunit of the TIM23 complex involved in the recognition and coordinated transfer of precursor proteins. The functionally relevant part of Tim50, its IMS-exposed segment, was proposed to consist of two domains – the core and the presequence-binding domain (PBD). Understanding how the two domains of Tim50 in the IMS contribute to the function of Tim50 is very limited. This study provides new molecular insights into the functions and interaction partners of the individual domains of Tim50, as well as their interplay in the IMS and how they coordinate the translocation of proteins across two mitochondrial membranes. In vivo analysis performed in this thesis demonstrated that the deletion of either the core domain or PBD of Tim50 is lethal for yeast cells, showing that both domains of Tim50 in the IMS have a role essential for cell viability. Surprisingly, when expressed in trans, the two domains of Tim50 reconstituted the function of the full-length protein. Biochemical and genetic experiments performed with this 50split strain revealed that the core domain contains the main presequence-binding site and is the main recruitment point of Tim50 to the TIM23 complex, with a supporting role of the PBD. On the other hand, a critical role of the PBD appears to be in coordinating, directly or indirectly, the cooperation of the TOM and TIM23 complexes. Therefore, the two domains of Tim50 in the IMS both have essential but distinct roles during translocation of proteins into mitochondria. In summary, this study provides a compelling example of how to use experimental domain splitting to analyse functions and interactions of membrane proteins within multi-subunit complexes. A combination of genetic and biochemical assays made it possible to assign the critical functions of Tim50 to its individual domains and show that, together, they coordinate translocation of proteins across two mitochondrial membranes.

Abstract

Mitochondrien, die gemeinhin als „Kraftwerke der Zelle“ bezeichnet werden, sind nicht nur an der Energieerzeugung beteiligt. Vielmehr stellen sie eine zentrale Biosynthese- und Signaltransduktionsdrehscheibe für viele wichtige zelluläre Prozesse dar, die von der Synthese sowie dem Abbau von Metaboliten bis hin zur Apoptose reichen. Obwohl Mitochondrien ein eigenes Genom besitzen, kodiert dieses nur für eine sehr begrenzte Anzahl von Proteinen, sodass die mitochondriale Biogenese den Import von über 1000 verschiedenen im kern-kodierten Proteinen aus dem Zytosol erfordert. Die überwiegende Mehrheit dieser Proteine trägt ab spaltbare N-terminale Präsequenzen, die die Proteine in die mitochondriale Matrix dirigieren. Dieser Vorgang wird durch zwei hochspezifische Proteintranslokasen, die TOM- und TIM23-Komplexe in der äußeren sowie inneren Mitochondrienmembran, vermittelt. Mehrere Komponenten der TOM- und TIM23-Komplexe bilden ein kompliziertes Netzwerk aus Protein-Protein-Interaktionen im Intermembranraum, welches die Übergabe von Vorläuferproteinen von der äußeren zur inneren Mitochondrienmembran koordiniert. Durch Interaktionen mit ankommenden Vorläuferproteinen und mehreren Untereinheiten beider Proteintranslokasen ist Tim50 der zentrale Akteur in diesem Netzwerk und als wichtigste Rezeptoruntereinheit des TIM23-Komplexes an der Erkennung und der koordinierten Übergabe von Vorläuferproteinen beteiligt. Es wurde vorgeschlagen, dass der funktionell relevante Teil von Tim50, sein Intermembran-exponiertes Proteinsegment, aus zwei Domänen besteht - die Kern- und die Präsequenz-bindende Domäne (PBD). Das Verständnis darüber, wie die beiden Domänen im Intermembranraum zur Funktion von Tim50 beitragen, ist sehr begrenzt. Diese Studie liefert neue molekulare Erkenntnisse über die Funktionen und Interaktionspartner der einzelnen Domänen von Tim50 sowie über ihr Zusammenspiel im Intermembranraum und darüber, wie sie die Translokation von Proteinen durch zwei mitochondriale Membranen koordinieren. In vivo-Analysen im Rahmen dieser Arbeit, haben gezeigt, dass die Deletion der Kerndomäne oder der PBD von Tim50 für Hefezellen tödlich ist, was darauf hindeutet, dass beide Domänen von Tim50 im Intermembranraum eine für die Lebensfähigkeit der Zellen wichtige Rolle spielen. Überraschenderweise konnte die Koexpression beider Tim50 Domänen in trans die Funktion des Volllängenproteins wiederherstellen. Biochemische und genetische Experimente mit dem sogenannten 50split-Stamm zeigten, dass die Kerndomäne die Hauptbindestelle für Präsequenzen enthält und für Tim50 der Hauptrekrutierungsort zum TIM23-Komplex ist, wobei die PBD dabei eine unterstützende Rolle besitzt. Andererseits scheint die PBD direkt oder indirekt bei der Koordinierung der Zusammenarbeit der TOM- und TIM23-Komplexe beteiligt zu sein. Die beiden Domänen von Tim50 im Intermembranraum spielen also beide eine wesentliche, aber unterschiedliche Rolle bei der Translokation von Proteinen in die Mitochondrien. Zusammengefasst liefert diese Arbeit ein überzeugendes Beispiel, wie die experimentelle Aufspaltung von Proteindomänen zur Analyse der Funktionen und Interaktionen von Membranproteinen innerhalb von Proteinkomplexen mit mehreren Untereinheiten eingesetzt werden kann. Durch eine Kombination aus genetischen und biochemischen Experimenten konnten die kritischen Funktionen von Tim50 seinen einzelnen Domänen zugeordnet werden, und gezeigt werden, dass sie zusammen die Translokation von Proteinen durch zwei mitochondriale Membranen koordinieren.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Mitochondria, protein translocation, TOM-TIM23 coordination, TIM23 complex, Tim50
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
• Fakultäten: Fakultät für Biologie
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 22. März 2024
• 1. Bericht­erstatter:in: Mokranjac, Dejana