Characterization of SPFH domain containing proteins in Bacillus subtilis

Savietto Scholz, Abigail (2024): Characterization of SPFH domain containing proteins in Bacillus subtilis. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie

Abstract

Every living cell is enclosed by a flexible and dynamic membrane made of phospholipids and proteins. The bacterial plasma membrane and its proteins play a central role throughout the bacterial life cycle, promoting membrane compartmentalization for specific biochemical and molecular processes to occur in a correct time and place. The membrane also shields the cell from harmful chemicals and other threats. In bacteria and some eukaryotic organisms, a rigid structure known as the cell wall sits outside of the membrane and determines the cellular shape. The membrane adapts its composition and fluidity through a series of molecular interactions, which are critical for downstream cellular processes like membrane surveillance, repair, cell growth and division to work properly. Here, we aimed to describe and characterize aspects of membrane biology and bacterial membrane fluidity homeostasis, with focus on the characterization of the three known Stomatin-Prohibitin, Flotillin, HflK/C (SPFH)-domain proteins in Bacillus subtilis, namely the two flotillin proteins FloT and FloA, and YdjI. These proteins are genetically regulated by the ECF sigma factor σw which is triggered by membrane stressors such as alkaline shock, high salt concentrations, and phage infection. These proteins have been shown to be involved in membrane protection and direct regulation of membrane fluidity. This thesis describes in the Chapter 2.1 a direct influence of membrane fluidity on MreB dynamics. Absence of flotillins reduces membrane fluidity, thereby altering MreB velocity and as consequences, in peptidoglycan synthesis. When bacterial cells lacking flotillins were treated with a membrane fluidizer, these phenotypes were suppressed. Further experiments revealed that flotillin FloT has an important impact on the ordering parameter along the entire acyl chain of phospholipids in model membranes, increasing dynamics of these molecules and, as consequence, increasing the membrane's fluidity. Fluidity in that sense, is a key physical parameter of the membrane that changes rapidly depending on the environment. Altogether, the results suggest a direct role of flotillins in maintenance of membrane’s fluidity homeostasis, rather than for the formation of lipid scaffolds for other proteins to take place (bacterial “lipid rafts”), as previously thought. The proteins containing the SPFH domain in B. subtilis, including bacterial flotillins, have been shown to be involved in membrane protection and membrane fluidity regulation, since they have the same genetic regulation by σw. Therefore, we further characterized a third bacterial SPFH-domain protein YdjI that is part of a stress induced complex in B. subtilis. In the Chapter 2.2, we show that YdjI requires the help of two membrane integral proteins, YdjG/H, to localize the ESCRT-III homolog PspA to the membrane. Moreover, YdjI, unlike classical flotillins, was found in fluid membrane regions and was not enriched in detergent-resistant membrane fractions. However, deletion of YdjI reduced membrane fluidity, similarly to FloA and FloT deletion in B. subtilis. Our findings show that the membrane repair performed by phage-shock response system and the regulation of membrane fluidization and homeostasis driven by SPFH-domain proteins are closely intertwined.

Abstract

Lebende Zellen sind umgeben von flexiblen, dynamischen Membranen, die aus Phospholipiden und Proteinen bestehen. Die Bakterienmembran und ihre Proteine spielen während des gesamten bakteriellen Lebenszyklus eine zentrale Rolle: Sie fördern die Kompartimentierung der Membran, damit spezifische biochemische und molekulare Prozesse zur rechten Zeit am richtigen Ort ablaufen können. Die Membran schützt die Zelle auch vor schädlichen Chemikalien und anderen Bedrohungen. Bei Bakterien und einigen eukaryotischen Organismen befindet sich außerhalb der Membran eine starre Struktur, die als Zellwand bezeichnet wird und die Form der Zelle bestimmt. Die Membran hält die Homöostase durch eine Reihe von molekularen Wechselwirkungen aufrecht, die für das ordnungsgemäße Funktionieren nachgelagerter zellulärer Prozesse wie Membranintegrität, Reparatur, Zellwachstum und Zellteilung von entscheidender Bedeutung sind. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse beschreiben und charakterisieren Aspekte der Membranbiologie und der bakteriellen Membranhomöostase, wobei der Schwerpunkt auf der Charakterisierung der drei bekannten Stomatins-Prohibitins-Flotillins-HflK/C (SPFH)-Domänenproteine in B. subtilis liegt. Dieses sind die beiden Flotillin-Proteine FloT und FloA, sowie YdjI, welche nachweislich am Membranschutz und der direkten Regulierung der Membranfluidität beteiligt sind. In der ersten Veröffentlichung zeigten wir mit Hilfe von Mikroskopietechniken, dass sich MreB in Gegenwart von Flotillinen schneller durch die Membran bewegt, als wenn keine Flotilline vorhanden sind: ein Hinweis darauf, dass Peptidoglycan-Synthese aktiver ist. Ähnliche Ergebnisse wurden nach Gabe eines Membranfluidisators auf Bakterienzellen erzielt, denen Flotilline fehlten. Weitere Experimente zeigten, dass die Flotilline es den Phospholipidmolekülen in einer künstlichen Membran ermöglichten, sich freier zu bewegen, was die Fluidität der Membran erhöhte. Insgesamt deuten die Ergebnisse auf eine direkte Rolle der Flotilline bei der Aufrechterhaltung der Membranfluiditäthomöostase hin, und nicht - wie bisher angenommen - auf die Bildung von Membrandomäne (sogenannten bakteriellen "Lipid Rafts") über direkte Protein-Lipid-Wechselwirkungen. Da sich zeigte, dass die Proteine mit der SPFH-Domäne - einschließlich der bakteriellen Flotilline - am Membranschutz und an der Regulierung der Membranfluidität beteiligt sind, charakterisierten wir ein drittes bakterielles Protein mit SPFH-Domäne: YdjI. Dieses Protein ist Teil eines stressinduzierten Komplexes in B. subtilis. In einer zweiten Veröffentlichung zeigten wir, dass YdjI die Hilfe von zwei membranintegralen Proteinen YdjG/H benötigt, um das ESCRT-III-Homolog PspA an der Membran zu lokalisieren. Darüber hinaus ist YdjI im Gegensatz zu den klassischen Flotillinen in flüssigen Membranregionen zu finden und wird nicht in detergenzienresistenten Membranfraktionen angereichert. Die Deletion von YdjI reduziert die Membranfluidität, ebenso wie die Deletion von FloA und FloT aus B. subtilis. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Membranreparatur durch das Phagen-Schock-System und die Regulierung der Membranfluidisierung und homöostase, durch SPFH-Domänenproteine eng miteinander verwoben sind.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Bacillus subtilis, stress response, membrane fluidity, bacterial flotillins, SPFH proteins
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
• Fakultäten: Fakultät für Biologie
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 19. März 2024
• 1. Bericht­erstatter:in: Bramkamp, Marc