Klonierung und pharmakologische Charakterisierung der caninen Opioidrezeptoren

Gerdes, Elena Katharina (2024): Klonierung und pharmakologische Charakterisierung der caninen Opioidrezeptoren. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät

Abstract

Opioidanalgetika weisen beim Hund tierartliche Unterschiede im Wirkprofil auf, die nicht durch pharmakokinetische Besonderheiten im Arzneimittelmetabolismus erklärt werden können. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war es daher, die caninen µ und k-Opioidrezeptoren (OPRM1 und OPRK1) zu klonieren und die Ligandenprofile der therapeutisch eingesetzten Opioidanalgetika an den exprimierten Rezeptoren zu charakterisieren. Die Klonierung der caninen Opioidrezeptoren erfolgte mit speziell abgeleiteten PCR-Primern, da das Hundegenom nur unvollständig sequenziert war und die annotierten Opioidrezeptorgene fehlerhaft waren. Die isolierten cDNA-Sequenzen des OPRM1 und des OPKR1 konnten daraufhin strukturell mit anderen Spezies verglichen werden. In einem nächsten Schritt wurden die pharmakologischen Wirkprofile von Opioidanalgetika anhand der stabil in HEK 293-Zellen exprimierten MOR und KOR charakterisiert. Dabei wurde die Affinität mit Hilfe der Radioligandenbindung und die intrinsische Aktivität anhand der stimulierten MAP-Kinase Aktivität bestimmt. Daraus wurden individuelle Ligandenprofile für den Hund erstellt und mit denjenigen für den MOR der Ratte und den KOR des Menschen verglichen. Trotz einiger Aminosäuresubstitutionen in den caninen Opioidrezeptoren waren keine funktionellen Unterschiede in den Ligandenprofilen der vollen µ-Agonisten (Fentanyl und Levomethadon), jedoch eine Auswirkung auf die funktionellen Eigenschaften partieller Agonisten zu beobachten. Vor allem bei Morphin ist am caninen MOR eine, um den Faktor 6,3 höhere Affinität im Vergleich zum Rezeptor der Ratte und eine starke partielle Aktivität zu beobachten. Morphin stellt beim Hund ebenfalls einen starken partiellen Agonisten am KOR dar, wenn auch bei einer um den Faktor 63 niedrigeren Affinität verglichen mit dem MOR. Butorphanol weist dagegen eine um den Faktor 3,2 niedrigere Affinität am KOR des Hundes im Vergleich zum Rezeptor des Menschen auf, stellt jedoch beim Hund einen vollen Agonisten an diesem Rezeptor dar. Am MOR des Hundeszeigt Butorphanol dagegen keine intrinsische Aktivität obwohl es eine um den Faktor 10 höhere Affinität als am KOR aufweist. Schließlich weist Buprenorphin am MOR des Hundes keine nennenswerte intrinsische Aktivität auf, obwohl es eine vergleichbare Affinität zum Rezeptor der Ratte besitzt. Am KOR des Hundes besitzt Buprenorphin dagegen nur eine äußerst niedrige Affinität und geringe partielle intrinsische Aktivität. Zusammenfassen können die erarbeiteten Ligandenprofile die tierartlichen Unterschiede in den Indikationsgebieten der zugelassenen Tierarzneimittel erklären. Butorphanol besitzt einerseits gute analgetische Eigenschaften beim viszeralen Schmerz, wirkt aber andererseitsin den klinisch verwendeten Dosierungen stark sedativ. Dies konnte hier durch seine volle intrinsische Aktivität am KOR bei gleichzeitig hoher Affinität und keiner signifikanten intrinsischen Aktivität am MOR erklärt werden. Der klinische Einsatz von Buprenorphin dagegen ist beim Hund zu hinterfragen, da es nur einen schwachen partiellen Agonisten am KOR und Antagonisten am MOR darstellt.

Abstract

Opioid analgesics exhibit species-specific differences in their efficacy profile in dogs, which cannot be explained by pharmacokinetic characteristics in drug metabolism. Therefore, the objective of the present work was to clone the canine µ and k opioid receptors (OPRM1 and OPRK1) and to characterize the ligand profiles of the therapeutically used canine opioid analgesics at the expressed receptors. Cloning of the canine opioid receptors was performed using specially derived PCR primers because the canine genome was incompletely sequenced and the annotated opioid receptor genes were erroneous. The isolated cDNA sequences of OPRM1 and OPKR1 could then be compared structurally with other species. In a next step, the pharmacological action profiles of opioid analgesics were characterized using MOR and KOR stably expressed in HEK 293 cells. Affinity was determined using radioligand binding and intrinsic activity was determined using stimulated MAP kinase activity. From this, individual ligand profiles were generated for the dog and compared with those for the rat MOR and the human KOR. Despite some amino acid substitutions in the canine opioid receptors, no functional differences were observed in the ligand profiles of the full µ-agonists (fentanyl and levomethadone), but an effect on the functional properties of partial agonists was observed. In particular for morphine, by a factor of 6.3 higher affinity is observed at the canine MOR compared to the rat receptor and additionally a strong partial activity is detected. Morphine is also a strong partial agonist at the KOR in dogs, albeit with a 63-fold lower affinity compared with MOR. Butorphanol, on the other hand, has a 3.2-fold lower affinity at the canine KOR compared with the human receptor, but represents a full agonist at this receptor in the dog. In contrast, at the canine MOR, butorphanol shows no intrinsic activity, although it has a factor of 10 higher affinity than at the KOR. Finally, buprenorphine has no appreciable intrinsic activity at the canine MOR, although it has comparable affinity for the rat receptor. In contrast, at the canine KOR, buprenorphine has extremely low affinity and only weak partial intrinsic activity. In summary, the elaborated ligand profiles can explain the animal-species differences in the indications of the approved veterinary drugs. On the one hand, butorphanol has good analgesic properties in visceral pain, on the other hand it has a strong sedative effect at the clinically used doses. This is shown here by its full intrinsic activity at the KOR with simultaneous high affinity and no significant activity at the MOR. The clinical use of buprenorphine, on the other hand, is to be questioned for dogs because it is only a weak partial agonist at the KOR and antagonist at the MOR.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Opioidrezeptoren, Hund, Fentanyl, Buprenorphin, Butorphanol, Morphin, Levomethadon
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 590 Tiere (Zoologie)
• Fakultäten: Tierärztliche Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 10. Februar 2024
• 1. Bericht­erstatter:in: Ammer, Hermann