Single-molecule fluorescence studies of transport initiation in the maltose importer MalEFGK2

Mächtel, Rebecca (2023): Single-molecule fluorescence studies of transport initiation in the maltose importer MalEFGK2. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie

Abstract

ATP-binding cassette (ABC) transporters are essential membrane proteins that mediate active import and export processes in all kingdoms of life. MalEFGK2 is an important multi-domain protein responsible for maltodextrin import in E. coli. The protein complex uses a series of conformational changes for transport driven by ATP hydrolysis. First, the periplasmic substrate binding protein (SBP) MalE binds substrates with high affinity and delivers them to the transmembrane domains (TMDs) MalF and MalG. Two cytoplasmic nucleotide binding domains (NBDs) MalK2 trigger the required conformational changes from the outward-open (maltose uptake) to inward-open (maltose release) states of the TMDs using ATP binding and hydrolysis. While the system is well characterised from a functional and a structural viewpoint, the precise coordination of conformational dynamics, kinetics, and transport regulation is not fully understood. In this thesis, new biophysical approaches and assays (single-molecule Förster resonance energy transfer (smFRET), fluorescence correlation spectroscopy (FCS), fluorescence quenching, and combinations thereof) were established to study conformational changes and interactions between protein domains within MalEFGK2. First, I designed new smFRET assays to monitor intramolecular conformational states of MalE, in which the fluorescent labels do not inhibit the biochemical activity of MalEFGK2. The established library of protein variants was also used as basis for fluorophore characterisation, development and refinement of new methods, and comparison of smFRET in structural biology (see Chapter 5.1). Next, contact-induced fluorescent quenching of dye molecules was established to sense the conformational state of MalE using single-color fluorescence assays. The use of such assays will be the observation of correlated movement in MalEFGK2 with reduced experimental complexity (see Chapter 5.2). Finally, fluorescence assays based on smFRET and fluorophore quenching were designed to monitor the initial step of transport, i.e. docking of MalE to the TMDs. For this, the interaction of MalE with anodisc-reconstituted MalFGK2 and the isolated MaF-P2 loop was studied based on an smFRET assay, where open and closed states of the binding protein and the docking state can be discerned. The presented results exclude and falsify a mechanism in which the P2 loop causes a pre-activation state of MalE, but give indices that binding to the complete TMD docking interface causes a change in MalE’s opening degree before substrate binding and transport (see Chapter 5.3). Since the precise coordination of conformational motion in the different transporter domains (MalE: open/closed; TMDs: outward-/inward-open) in relation to the presence of distinct ligands and ATP are not fully understood, I hypothesise that the presented methods to visualise correlated movement, e.g. substrate binding and docking simultaneously, will prove useful in the future. They can serve as a starting point for complicated studies of the entire transporter complex and related transporter systems, also in more native-like environments, to directly visualise protein-protein interactions, triggering of conformational dynamics, and the correlated movement of the protein domains.

Abstract

Transportproteine mit ATP-bindender Kassette (ABC-Transporter) sind wichtige Membranproteine, die in allen Organismen aktiven Import und Export von Substraten vermitteln. MalEFGK2 ist ein Mehrdomänenprotein, das für den Import von Maltodextrinen in E. coli verantwortlich ist. Der Proteinkomplex nutzt eine Abfolge von konformellen Änderungen für den ATP-abhängigen Transport. Zuerst bindet das Substratbindeprotein (SBP) MalE im Periplasma die Substrate mit hoher Affinität und transferiert diese zu den Transmembrandomänen (TMDs) MalF und MalG. Die beiden Nukleotidbindedomänen (NBDs) MalK2 im Zytoplasma sorgen für die notwendigen Konformationsänderungen von einem nach außen geöffneten (Maltoseaufnahme) zu einem nach innen geöffneten (Maltosefreisetzung) Zustand der TMDs unter ATP-Bindung und -Hydrolyse. Obwohl das System hinsichtlich seiner Funktion und Struktur gut beschrieben ist, konnte die genaue Koordination von konformellen Änderungen, Transportkinetik und -regulation noch nicht vollständig aufgeklärt werden. In der vorliegenden Doktorarbeit wurden neue biophysikalische Ansätze und Verfahren entwickelt (Einzelmolekül Förster Resonanz Energietransfer (smFRET), Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS), Fluoreszenzlöschung und deren Kombination), um konformelle Änderungen und Interaktionen zwischen den Proteindomänen in MalEFGK2 zu untersuchen. Erstes Ziel war die Etablierung neuer smFRET-Methoden, um die intramolekularen Konformationsänderungen von MalE zu analysieren, ohne dass die erforderlichen Fluoreszenzmoleküle die biochemische Aktivität von MalFGK2 beeinflussen. Die erstellte Bibliothek von Proteinvarianten diente weiterhin als Grundlage für die Charakterisierung von Fluorophoren, die Entwicklung und Verfeinerung neuer Methoden und dem Vergleich von smFRET mit anderen strukturbiologische Methoden (siehe Kapitel 5.1). Als Nächstes wurde die kontaktinduzierte Fluoreszenzlöschung von Farbstoffmolekülen an MalE erprobt, um dessen Konformationszustand mithilfe von einzelnen Fluorophoren zu erfassen. Der Einsatz dieser Methode ermöglicht die Beobachtung der korrelierten Bewegungen von MalEFGK2 bei reduziertem experimentellen Aufwand (siehe Kapitel 5.2). Schließlich wurden Fluoreszenzassays auf der Grundlage von smFRET und Fluoreszenzlöschung entwickelt, um den ersten Schritt des Transports, d. h. das Andocken von MalE an die TMDs, sichtbar zu machen. Dazu wurde die Wechselwirkung von MalE mit Nanodisc-rekonstituiertem MalFGK2 sowie der isolierten MaF-P2-Schleife mittels smFRET untersucht, bei dem sowohl offene und geschlossene Zustände des Bindungsproteins als auch der Andockzustand unterschieden werden können. Die vorgestellten Ergebnisse schließen einen Mechanismus aus, bei dem eine Voraktivierung von MalE durch die P2-Schleife erfolgt, geben jedoch Hinweise darauf, dass sich MalE bei Bindung an die komplette TMD-Oberfläche teilweise schließt, selbst wenn noch keine Substratbindung und kein Transport erfolgen (siehe Kapitel 5.3). Da die genaue Koordination der Konformationsbewegung in den verschiedenen Transporterdomänen (MalE: offen/geschlossen; TMDs: nach außen/nach innen geöffnet) in Bezug auf die Anwesenheit verschiedener Liganden und ATP noch nicht vollständig verstanden ist, können sich die vorgestellten Methoden zur Visualisierung korrelierter Bewegungen (z. B. Substratbindung und Andocken) in Zukunft als nützlich erweisen. Sie können als Ausgangspunkt für anspruchsvolle Studien des gesamten Transporterkomplexes und verwandter Transportersysteme in deren natürlichen Umgebungen dienen, um Protein-Protein-Wechselwirkungen, die Auslösemechanismen der Konformationsänderungen und die korrelierten Bewegungen der Proteindomänen sichtbar zu machen.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: MalE, maltose binding protein, MalFGK2, FRET, quenching, FCS, conformations, P2 loop
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
• Fakultäten: Fakultät für Biologie
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 10. November 2023
• 1. Bericht­erstatter:in: Cordes, Thorben