Single molecule MATAC-seq reveals key determinants for DNA replication efficiency

Chanou, Anna (2023): Single molecule MATAC-seq reveals key determinants for DNA replication efficiency. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie

Abstract

The stochastic nature of origin activation results in significant variability in the way genome replication is carried out from cell to cell. The reason for the diversity in efficiency and timing of individual origins has remained an unresolved issue for a long time. Cell-to-cell variability has been demonstrated to play a crucial role in cellular plasticity and cancer in mammalian cells. Although population-based methods have provided valuable insight into biological processes, it is necessary to use single molecule techniques to uncover events that are hidden by the population average. Many biological processes, such as DNA replication, transcription, and gene expression, are closely linked to the local chromatin structure. In yeast, although DNA replication origins have conserved DNA sequences, they display remarkable differences in timing and efficiency. Some origins initiate replication earlier during S-phase or more frequently than others, resulting in a high degree of heterogeneity among the cells in a population, with no two cells having the exact same replication profile. Our hypothesis is that the local nucleosomal structure may affect the DNA replication profile of individual origins. To explore this relationship, we have developed Methylation Accessibility of Targeted Chromatin domain Sequencing (MATAC-Seq) to determine single-molecule chromatin accessibility maps of specific genomic locations after targeted purification in their native chromatin context. Our analysis of selected early-efficient (EE) and late-inefficient (LI) replication origins in Saccharomyces cerevisiae using MATAC-Seq revealed significant cell-to-cell heterogeneity in their chromatin states. Disrupting the INO80 or ISW2 chromatin remodeling complexes led to changes at individual nucleosomal positions that correspond to changes in replication efficiency. Our results show that a chromatin state with a narrow size of accessible origin DNA in combination with well-positioned surrounding nucleosomes and an open +2 linker region was a strong predictor for efficient origin activation. MATAC-Seq provides a single-molecule assay for chromatin accessibility that reveals the large spectrum of alternative chromatin states that coexist at a given locus, which was previously masked in population-based experiments. This provides a mechanistic basis for origin activation heterogeneity that occurs during DNA replication in eukaryotic cells. As a result, our single-molecule assay for chromatin accessibility will be ideal for defining single-molecule heterogeneity across many biological processes, such as transcription, replication, or DNA repair in vitro and ex vivo.

Abstract

Die stochastische Natur der Aktivierung von Replikationsursprüngen führt zu einer signifikanten Variabilität in der Art und Weise, wie die DNA Replikation von Zelle zu Zelle durchgeführt wird. Der Grund für die Diversität in Effizienz und Zeitpunkt der individuellen Aktivierung von Ursprüngen blieb lange ein ungelöstes Problem. Es wurde gezeigt, dass die Zell-zu-Zell-Variabilität eine entscheidende Rolle bei der zellulären Plastizität und Krebs in Säugetierzellen spielt. Obwohl populationsbasierte Methoden wertvolle Einblicke in biologische Prozesse geliefert haben, ist es notwendig, Einzelmolekültechniken zu verwenden, um Ereignisse aufzudecken, die durch das Durchschnittsverhalten aller Moleküle verborgen sind. Viele biologische Prozesse wie DNA-Replikation, Transkription und Genexpression sind eng mit der lokalen Chromatinstruktur verbunden. Obwohl die DNA-Replikationsursprünge in Hefe konservierte DNA-Sequenzen aufweisen, zeigen sie bemerkenswerte Unterschiede im Zeitpunkt und Effizienz der Replikation. Einige Ursprünge initiieren die Replikation früher während der S-Phase oder häufiger als andere, was zu einem hohen Grad an Heterogenität zwischen den Zellen in einer Population führt, wobei keine zwei Zellen das exakt gleiche Replikationsprofil aufweisen. Unsere Hypothese ist, dass die lokale nukleosomale Struktur das DNA-Replikationsprofil beeinflussen kann. Um diese Beziehung zu untersuchen, haben wir Methylation Accessibility of Targeted Chromatin Domain Sequencing (MATAC-Seq) entwickelt, um Einzelmolekül-Chromatin-Zugänglichkeitskarten spezifischer genomischer Orte nach gezielter Reinigung in ihrem nativen Chromatin-Kontext zu bestimmen. Unsere Analyse ausgewählter früh-effizient (EE) und spät-ineffizient (LI) feuernde Replikationsursprünge in Saccharomyces cerevisiae mit MATAC-Seq ergab eine signifikante Zell-zu-Zell-Heterogenität in ihren Chromatinzuständen. Die genetische Deletion der INO80- oder ISW2-Chromatin-Remodeling Komplexe führte zu Veränderungen an einzelnen nukleosomalen Positionen, die mit Veränderungen der Replikationseffizienz korrespondierten. Unsere Ergebnisse zeigten, dass ein Chromatinzustand mit einem engen Fenster an zugänglicher Replikationsursprungs-DNA in Kombination mit gut positionierten umgebenden Nukleosomen und einer offenen +2-Linkerregion ein starker Prädiktor für eine effiziente Ursprungsaktivierung war. MATAC-Seq bietet einen Einzelmolekül-Assay für die Zugänglichkeit von Chromatin, der das große Spektrum alternativer Chromatinzustände aufzeigt, die an einem bestimmten genomischen Lokus koexistieren, der zuvor in populationsbasierten Experimenten maskiert war. Dies liefert eine mechanistische Grundlage für die Heterogenität der Ursprungsaktivierung, die während der DNA-Replikation in eukaryotischen Zellen auftritt. Infolgedessen ist unser Einzelmolekül-Assay 5 für Chromatin-Zugänglichkeit ideal für die Definition der Einzelmolekül-Heterogenität über viele biologische Prozesse hinweg, wie z. B. Transkription, Replikation oder DNA-Reparatur in vitro und ex vivo.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: chromatin structure, nucleosomes, DNA replication, single-molecule analysis, heteregeneity
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
• Fakultäten: Fakultät für Biologie
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 27. Oktober 2023
• 1. Bericht­erstatter:in: Torres-Padilla, Maria Elena