Qualitätskontrolle der mitochondrialen DNA in S. cerevisiae

Jakubke, Sean Christopher (2023): Qualitätskontrolle der mitochondrialen DNA in S. cerevisiae. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie

Abstract

Die mitochondriale DNA (mtDNA) kodiert für essentielle Untereinheiten der Atmungskette. Mutationen der mtDNA können dazu führen, dass die Zelle ihre Fähigkeit verliert Energie über die Atmungskette zu generieren. Des Weiteren können solche mtDNA Mutationen im Menschen schwerwiegende Krankheiten wie Alzheimer oder Huntington fördern. Wie die Zelle die Integrität und Qualität ihrer mtDNA gewährleistet ist zum jetzigen Zeitpunkt nicht vollkommen aufgeschlüsselt worden. In dieser Arbeit wird untersucht, inwiefern der einzellige eukaryotische Organismus Saccharomyces cerevisiae im Stande ist zwischen mutierter und intakter mtDNA zu unterscheiden. Die Ergebnisse zeigen darüber hinaus, dass Tochterzellen im Vergleich zu deren Mutterzellen, über signifikant mehr intakte mtDNA verfügen. Weiterhin wird aufgezeigt, welche Gene und strukturelle Veränderungen innerhalb der Zellen zu einer Beeinträchtigung der Qualitätssicherung beitragen. Auf Basis der durchgeführten Experimente wurde ersichtlich, dass die Qualitätssicherung der mtDNA, entgegen einer verbreiteten Annahme, nicht auf dem Prozess der Fission, sondern mehr auf der Aufrechterhaltung einer intakten mitochondrialen Struktur beruht. Der Prozess der Autophagie stellt ebenfalls für die Detektion intakter mtDNA keine Relevanz dar. Ein Kernelement bildet die Erkenntnis, dass vor allem die Cristae-Morphologie maßgeblich an der Qualitätssicherung der mtDNA beteiligt ist. Eine Deletion der an der Cristae-Struktur involvierten Gene Δatp20, Δatp21, Δmic10 oder Δmic60 führt zu einem Verlust der Qualitätskontrolle gegenüber dem Wildtyp (WT). Außerdem wurde genetisch veränderte Hefe verwendet, um zu beweisen, dass die mtDNA ihre Proteine an nahegelegene Atmungsketten-Komplexe überträgt. Diese Abgabe, welche auf einer intakten Cristae-Morphologie basiert, ist lokal streng kontrolliert und limitiert. Die Diffusion der mtDNA wird hingegen in den untersuchten Mutanten nicht beeinträchtigt. Dies könnte auf eine interne Verankerung der mtDNA hindeuten. Elektronenmikroskopische Aufnahmen der untersuchten Δatp20, Δatp21 und Δatp20Δatp21 Mutanten weisen Septen als dominierende interne Strukturen auf. Innerhalb dieser Strukturen ist es der Zelle nicht möglich, die nun stark diffundierenden Proteine eindeutig der mutierten oder intakten mtDNA zuzuordnen. Abschließend kann somit aufgezeigt werden, dass Hefezellen eine Unterscheidung zwischen intakter und defekter mtDNA vornehmen. Dies konnte sowohl in größeren Populationen als auch auf Einzelzellebene nachgewiesen werden. Defekte Cristae-Strukturen führen zu einer Beeinträchtigung der Qualitätssicherung. Somit ist eine intakte mitochondriale Struktur der Cristae der Schlüsselpunkt zur mitochondrialen Qualitätssicherung. Im Laufe dieser Arbeit wurden wir mit einigen limitierenden Faktoren in der Daten- und Bildanalyse konfrontiert. Eine Erhöhung der Probenanzahl, die in einigen der mikroskopischen Experimenten verwendet wurden, führte zu einer aussagekräftigeren Statistik. Das Alignment der zwei Fluoreszenzkanäle, die Nachbearbeitung der Bilder, sowie die finale Statistik, stellte uns vor neue Herausforderungen. Im Rahmen einer Kollaboration mit der Arbeitsgruppe Leonhardt der LMU haben wir die erwähnten limitierenden Faktoren adressieren können. Die AG Leonhardt kombiniert ein umfangreiches Verständnis verschiedenster mikroskopischer Verfahrenstechniken, mit dem Wissen große Datenmengen über Deep-Learning Algorithmen auszuwerten. So entwickelten wir gemeinsam den YeastMate-Algorithmus. Basierend auf den aufgenommenen Hellfeldaufnahmen überlagerte die Software die mit separaten Kameras aufgenommenen Fluoreszenzkanäle auf den Pixel genau und erstellte eine Maske, um Hefezellen zu identifizieren, welche unseren vorab definierten Kriterien entsprachen. Die Software sollte ausschließlich Bereiche mit Hefezellen detektieren, welche aus zwei verpaarten Zellen inklusive einer neu entstandenen Tochterzelle bestanden. Diese Zellen wurden anschließend einzeln aus dem Gesamtbild ausgeschnitten und für die weitere Analyse abgelegt. Die Software ermöglichte es ebenfalls Zellen über mehrere Zellteilungen hinweg zu verfolgen und Knospungsereignisse zu detektieren. Am Ende hat uns dieser Algorithmus geholfen, alle Prozesse der Bildbearbeitung erheblich zu vereinfach und zu beschleunigen, so konnte die Anzahl der verwendeten Proben für einige Analysen drastisch erhöht werden. Ein weiterer positiver Effekt war es, dass subjektive Einflüsse minimiert werden konnten, da alle Bilder identisch über die Software verarbeitet und bearbeitet wurden.

Abstract

The mitochondrial genome (mtDNA) encodes for essential subunits of the mitochondrial respiratory chain and the ATP synthase. Mutations of the mtDNA can cause shortage in cellular energy supply, which can contribute to a multitude of mitochondrial diseases in humans, like metabolic strokes, arrhythmias or cognitive disabilities. Therefore, it is essential for a cell and its progeny, to promote a healthy mtDNA state. How cells secure mtDNA integrity over generations remains still unclear. In this work, we show that the single-celled yeast Saccharomyces cerevisiae can intracellularly distinguish between intact and defective mtDNA and promote a generation of daughter cells with healthy mtDNA content. Selection for intact mtDNA occurs in a continuous mitochondrial network in the absence of mitochondrial fission and autophagy, but requires normal cristae morphology. A deletion of genes, which are essential for a normal cristae-morphology, e.g. Δatp20, Δatp21, Δmic10 or Δmic60, cause a defect in detection and selection towards healthy mtDNA. Using genetically modified mtDNA, we show that mtDNA supplies proteins to mitochondrial subdomains, whose stability depends on normal cristae morphology. Here we propose that mtDNA determines functionality of mitochondrial subdomains in a cristae dependent manner, which facilitates clearance of mutant mtDNA from daughter cells. Furthermore, the diffusion of mtDNA is not affected by the deletion of cristae-morphology proteins, indicating the presence of a mtDNA tether, holding the mtDNA at distinct places in the mitochondrial network. Electron microscopic images illustrate septea in Δatp20, Δatp21 and Δatp20Δatp21 deletion strains. Those strains show increased diffusion of mtDNA-encoded and nuclear-encoded proteins of the respiratory chain compared to WT cells. This could explain the defect in mtDNA quality control, which could be a direct result of the altered cristae morphology. During this work we were facing some limiting factors in the data and imaging analysis. We had to drastically increase the number of samples, which have been analyzed in some of the microscopic assays, to perform more powerful and valid statistics. We were faced with new technical problems due to the alignment of the used fluorescent channels, the post processing of the images, as well as the final statistics. We collaborated with the group of Prof Leonhardt. The AG Leonhardt of the LMU combines a good understanding of fluorescent microscopy as well as large sample analysis and deep learning algorithms. During this collaboration we created the user-friendly YeastMate-Software. The YeastMate-Algorithm was the solution to the mentioned problems. Based on the brightfield images, the Software created a mask to identify and crop yeast cells which were matching our expectations. It also performs the alignment of the two used fluorescent channels and could also follow cells in their lifespan and detect a budding event. In the end the algorithm helped us to significantly simplify and speed up this process and also it helped us to reduce the risk of a bias in image editing and post processing of the microscopic images. It drastically increase the amount of samples which were used for the finals plots and statistics.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
• Fakultäten: Fakultät für Biologie
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 14. Juli 2023
• 1. Bericht­erstatter:in: Osman, Christof