Characterisation of two essential proteins for host cell egress and invasion identified by phenotypic screening in Toxoplasma gondii

Li, Wei (2023): Characterisation of two essential proteins for host cell egress and invasion identified by phenotypic screening in Toxoplasma gondii. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät

Abstract

The apicomplexan parasite T. gondii is an obligate intracellular parasite that can infect almost all warm-blooded animals, including humans. Egress from host cells is the prerequisite for its dissemination. However, the exact steps that lead to egress are still poorly understood. During replication, the parasites establish an intravacuolar F-actin network that connects individual parasites and is essential for synchronous replication and material exchange between parasites. During egress, this network rapidly disintegrates before parasite motility and egress are activated, indicating a tight regulation of F-actin disassembly and activation of the motility machinery for egress. To identify novel factors involved in this regulation, a pooled gRNA library, which targets 320 genes predicted to be fitness-conferring according to a recent genome-wide in vitro screen, was transfected into a parasite line that expresses a regulatable Cas9 (sCas9). We successfully identified genes required for egress during the asexual life cycle. Further characterisation of two of these candidates indicated that they are essential for invasion and egress from host cells and that they act at distinct time points during this process. The signalling linking factor (SLF), an essential component of the guanylate cyclase (GC) signalling complex, is essential for the early induction of egress, acting upstream of Ca2+ signalling. The depletion of SLF led to no changes in F-actin upon induction with BIPPO. Whether SLF acts as a symporter is still uncertain. In contrast, the new conoidal protein named conoid gliding protein (CGP) acts at a later step in egress, downstream of Ca2+ signalling, and is necessary for the activation of gliding motility. Upon egress induction, F-actin networks disassemble but without F-actin accumulation at the basal pole. Furthermore, CGP might form a complex at the preconoidal rings, revealed by proximity-dependent biotin identification (BioID). Within this complex, here named gliding initiation complex (GIC), a novel methyltransferase (PCKMT), an actin nucleator formin1 (FRM1) and CGP are the core components. Dispensable protein 1 (DAP1) and indispensable conserved apicomplexan protein 16 (ICAP16) might serve as accessory proteins. Collectively, this study revealed that SLF and CGP are crucial for the lytic cycle of parasites, and their role in egress broadens our understanding of the egress mechanism. The discovery of a new preconoidal complex incorporating CGP lays a foundation for future mechanistic research establishing their specific function in motility.

Abstract

T. gondii gehört zum Stamm der Apicomplexa und ist ein obligat intrazellulärer Parasit, der fast alle warmblütigen Tiere einschließlich des Menschen infizieren kann. Der Austritt aus der Wirtszelle ist die Voraussetzung für die Verbreitung dieses Parasiten. Die genauen Faktoren, die zum Austritt aus der Wirtszelle führen, sind jedoch noch kaum bekannt. Während der intrazellulären Replikation baut T. gondii ein intravakuoläres F-Aktin-Netzwerk auf, das die Parasiten in der parasitophoren Vakuole miteinander verbindet und für die synchrone Replikation sowie den Materialaustausch zwischen den einzelnen Parasiten unerlässlich ist. Kurz bevor die Parasiten die Wirtszelle aktiv verlassen, zerfällt dieses Aktin-basierte Netzwerk zwischen den einzelnen Parasiten. Anschließend bewegt sich der Parasit aktiv aus der Zelle, wobei diese Motilität auf der Polymerisation von F-Aktin beruht. Diese streng orchestrierte Regulierung von F-Aktin sowohl in der parasitophoren Vakuole als auch im Parasiten selbst, weist darauf hin, dass Aktin eine zentrale Rolle beim Austritt aus der Wirtszelle spielt. Um neue Faktoren zu identifizieren, die an dieser Regulation beteiligt sind, wurde eine gRNA-Bibliothek erstellt. Diese zielt auf insgesamt 320 Gene ab, welche laut einem kürzlich durchgeführten genomweiten in vitro-Screen als essentielle Gene indetifiziert wurden.Diese gRNA-Bibliothek wurde in eine spezielle Parasitenlinie transfiziert, die eine regulierbare Cas9 Endonuclease (sCas9) exprimiert. Mit diesem Vorgehen wurden erfolgreich Gene identifiziert, die während des asexuellen Lebenszyklus für den Austritt des Parasiten aus der Wirtszelle wichtig sind. Die genauere Charakterisierung von zwei dieser Kandidaten-Gene zeigte, dass diese für die Invasion und den Austritt aus Wirtszellen wesentlich sind. Zudem zeigte sich, dass sie während dieses Prozesses zu unterschiedlichen Zeitpunkten wirken. Der Signalling Linking Factor (SLF) ist ein wesentlicher Bestandteil der GC-Signalkaskade. Dieser ist für die frühe Induktion des Austritts unerlässlich, da er der Ca2+-Signalübertragung vorgeschaltet ist. Ein Knockout von SLF führte zu keinen Veränderungen von F-Aktin nach Induktion mit BIPPO. Ob SLF als Symporter fungiert, ist noch ungewiss. Im Gegensatz dazu zeigte die Charakterisierung des zweiten Gens, dass dieses zu einem späteren Zeitpunkt des Zellaustritts, nach der Ca2+-Signalgebung wirkt und für die Aktivierung der Motilität des Parasiten notwendig ist. Dieses Conoid-Protein wurde als Conoid-Gliding-Protein (CGP) benannt. Bei Induktion des Austritts wird das F-Aktin-Netzwerk zerlegt, dies geschieht jedoch ohne F-Aktin-Akkumulation am Basalpol der Parasiten. Durch proximitätsabhängige Biotinidentifikation (BioID) zeigte sich, dass CGP wahrscheinlich Bestandteil eines Komplexes an den präkonoidalen Ringen ist. Innerhalb dieses Komplexes, der als Gliding Initiation Complex (GIC) benannt wurde, bildet die neuartige Methyltransferase (PCKMT) zusammen mit dem Aktin-Nukleator FRM1 (Formin1) und CGP die Kernkomponenten des Komplexes, während DAP1 (Dispensable Protein 1) und ICAP16 (Indispensable Conserved Apicomplexan Protein 16) wahrscheinlich als akzessorische Proteine dienen. Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass SLF und CGP für den lytischen Zyklus von T. gondii entscheidende Faktoren sind. Ihre zeitliche Regulation beim Austritt des Parasiten aus der Zelle erweitert unser Verständnis des Austrittsmechanismus per se. Die Entdeckung eines neuen präkonoidalen Komplexes, der CGP enthält, bildet die Grundlage für zukünftige Studien, die dessen spezifische Funktion im Rahmen der Motilität des Parasiten aufdecken.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Toxoplasma gondii, egress, invasion, motility, CGP, SLF
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 590 Tiere (Zoologie)
• Fakultäten: Tierärztliche Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 11. Februar 2023
• 1. Bericht­erstatter:in: Meissner, Markus