Investigation of uptake and distribution of drugs via the lymphatic system

Jentschura, Felicitas Aline Carolyn (2023): Investigation of uptake and distribution of drugs via the lymphatic system. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät

Abstract

Oral and subcutaneous administration are the most commonly used routes of administration of pharmaceutics, since they are considered to be the safest form of drug delivery in addition to their cost-effective, patient-friendly handling. Nevertheless, oral bioavailability is limited by the physicochemical properties such as high molecular weight, low aqueous solubility and high lipophilicity (high log P). Also, the absorption and associated immune responses of subcutaneously administered large molecules are not completely understood, despite their extensive clinical use. Particularly in preclinical safety studies, the nature of side effects that occur after the second administration of a drug that was initially well tolerated, are not completely understood and can prevent further development of the drug. Determining the cellular composition of lymphatic fluid and enhancing targeted lymphatic absorption can improve understanding of immunological processes as well as oral and subcutaneous bioavailability. For investigation of lymphatic uptake and distribution of orally and subcutaneously administered drugs, a surgical method of cannulating the thoracic duct in male rats was established. In first experiments animals received an oral single dose of two different highly lipophilic compounds in a non-lipid or lipid vehicle. For analyzing concentrations, lymphatic fluid was collected until 6 hours after dosing. Due to the surgery related influence on the systemic uptake, satellite animals were used to measure the systemic uptake into plasma. The results showed that the pharmacokinetic properties of both compounds meet the requirements for lymphatic uptake. Rats treated with the lipid formulation demonstrated 6- or 11- fold higher concentrations of compounds in the lymphatic fluid compared to non-lipid formulation. This improvement of the lymphatic uptake resulted in a significant increase of the bioavailability of compounds. Additionally, a pilot study was conducted in which rats were injected subcutaneously with a T-cell activating antibody. Lymph and blood samples, collected in two different groups for up to 3 hours after compound administration were analyzed by the Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) analysis to evaluate the cellular compositions and the absorption pathway of the antibody. Besides the fact that lymphocytes were shown to be a main component of the lymph, making up on average 96.28 % of the cell population, it could be shown that the subcutaneously administered antibody was absorbed by the lymph. While significant T-cell activation was observed in non-operated animals, such an effect was not measurable in lymph cannulated animals, suggesting that the cannulation prevented the antibody from reaching the systemic circulation. In conclusion, a surgical model for investigating the role of the lymphatic system in the absorption of orally and subcutaneously administered drugs was successfully established. It was shown that oral bioavailability can be improved by lipid based formulations and that the indirect absorption route should gain more attention in formulation development. Furthermore, the establishment of the FACS analysis of lymph fluid paves the way for a better understanding of immunological processes after subcutaneous administration and can be used to further investigate the dynamics of the interaction of large molecules with the immune system

Abstract

Die orale und subkutane Applikation gehören zu den am häufigsten angewandten Darreichungsformen für Arzneimittel. Sie sind in ihrer Handhabung patientenfreundlich, ihre Herstellung und Anwendung ist kostengünstig im Vergleich zu intravenös verabreichten Medikamenten, und zudem gelten sie als besonders sicher. Die orale Bioverfügbarkeit ist allerdings durch physikalisch-chemische Eigenschaften wie hohes Molekulargewicht, hohen log P und geringe Wasserlöslichkeit beziehungsweise hohe Lipophilie limitiert. Auch die Absorption und die damit verbundenen Immunantworten von subkutan applizierten, großen Molekülen sind trotz ihres standardmäßigen Einsatzes nicht vollständig verstanden. Im Rahmen der Entwicklung von Human- und Veterinärarzneimitteln treten beispielsweise nach der zweiten Dosis eines zunächst gut vertragenen Medikaments oftmals unerklärliche Nebenwirkungen auf, die die Weiterentwicklung gefährden können. Aus diesem Grund sollen in dieser Arbeit die zelluläre Zusammensetzung von Lymphe analysiert werden, um ein besseres Verständnis immunologischer Prozesse zu ermöglichen. Zudem sollen durch die Untersuchung der lymphatischen Absorption Möglichkeiten identifiziert werden, die orale und subkutane Bioverfügbarkeit positiv beeinflussen. Für die Untersuchung der lymphatischen Aufnahme und Verteilung von oral und subkutan applizierten Arzneimitteln wurde ein chirurgisches Verfahren zur Kanülierung des Ductus thoracicus bei männlichen Ratten etabliert. In ersten Experimenten erhielten die Tiere eine orale Einzeldosis von zwei verschiedenen hoch lipophilen Substanzen in einer nicht-lipid- oder in einer lipid-basierten Formulierung. Zur Analyse der Konzentrationen wurde Lymphflüssigkeit über einen Zeitraum von bis zu 6 Stunden nach der Substanzgabe gesammelt. Wegen des chirurgischen Einflusses auf die systemische Absorption wurden zusätzlich Satellitentiere verwendet, um die systemische Aufnahme ins Plasma zu messen. Die Ergebnisse zeigten, dass beide Substanzen über die Lymphe aufgenommen werden, wie es anhand ihrer pharmakokinetischen Eigenschaften erwartet war. Ratten, die mit der Lipidformulierung behandelt wurden, zeigten eine 6- oder 11-fach Konzentrationserhöhung der Substanzen in der Lymphflüssigkeit, im Vergleich zu Ratten, die die nicht-lipid basierte Formulierung erhalten hatten. Diese Verbesserung der lymphatischen Aufnahme führte zu einer signifikanten Erhöhung der Bioverfügbarkeit. In einem zweiten Teil der Arbeit wurde eine Pilotstudie in Ratten durchgeführt, denen subkutan ein T-Zell-aktivierender Antikörper injiziert wurde. Anschließend wurden Lymph- und Blutproben über einen Zeitraum von 3 Stunden nach Substanzapplikation in zwei unterschiedlichen Gruppen gesammelt. Die Probenanalyse mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS), sollte Aufschluss über die zelluläre Zusammensetzung der Lymphe geben und durch den Antikörper induzierte potenzielle Veränderungen zeigen. Neben dem Ergebnis, dass durchschnittlich Lymphozyten mit einem Anteil von 96,28 % einen Hauptbestandteil der Lymphe bilden, konnte gezeigt werden, dass der subkutan applizierte Antikörper von der Lymphe aufgenommen wurde. Während bei nicht operierten Tieren eine signifikante T-Zell-Aktivierung im Blut festgestellt werden konnte, blieb ein solcher Effekt in der Gruppe der Lymph-kanülierten Tieren aus, was zeigt, dass der Antikörper durch die Operation die Blutzirkulation nicht erreichen konnte. Ein chirurgisches Modell mit dem die Rolle des lymphatischen Systems bei der Absorption von oral und subkutan applizierten Medikamenten untersucht werden kann, konnte im Rahmen dieser Arbeit erfolgreich etabliert werden. Mithilfe dieses Modells konnte gezeigt werden, dass die orale Bioverfügbarkeit durch lipidbasierte Formulierungen verbessert werden kann, weshalb dieser indirekte Aufnahmeweg, die lymphatische Absorption, bei der Formulierungsentwicklung stärker berücksichtigt werden sollte. Die zusätzliche Methodenetablierung der FACS-Analyse von Lymphflüssigkeit ermöglicht ein besseres Verständnis immunologischer Prozesse nach subkutaner Applikation und kann eingesetzt werden, um die Dynamik der Wechselwirkung großer Moleküle mit dem Immunsystem zu untersuchen.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 590 Tiere (Zoologie)
• Fakultäten: Tierärztliche Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 11. Februar 2023
• 1. Bericht­erstatter:in: Potschka, Heidrun