Engineering a microwell duct-on-chip technology to translate exocrine pancreatic organoids to a cancer model

Wiedenmann, Sandra (2022): Engineering a microwell duct-on-chip technology to translate exocrine pancreatic organoids to a cancer model. Dissertation, LMU München: Fakultät für Chemie und Pharmazie

Abstract

Das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) ist eine der tödlichsten Erkrankungen der exokrinen Bauchspeicheldrüse, für die uns relevante Frühdiagnosemarker fehlen. Um PDAC-Marker zu identifizieren, werden in vitro kultivierte exokrine Pankreasmodelle aus dem frühestmöglichen, präkanzerösen Stadium benötigt. Die Übertragung der Pankreasgang-Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) in in vitro-Krankheitsmodelle erfordert ein umfassendes Verständnis der Entwicklungsbahnen von pankreasspezifischen Zelltypen. In dieser Arbeit wurde eine Microwell-Chip-Technologie mit definierten mikrostrukturierten Strukturen entwickelt, um aus hiPSC differenzierte Vorläuferzellen des Pankreas (PP) in einer 3-dimensionalen Zellkultur zu assemblieren. Die Vorteile der Chip-Plattform sind i) die parallele Bildung von Hunderten gleichgroßer 3D-Zellaggregate, ii) eine Matrigel-freie Mikroumgebung, iii) die Kompatibilität mit hochauflösender Bildgebung, iv) die einfache Anwendbarkeit für verschiedene nachfolgende Analysen mit minimaler Störung und v) die Möglichkeit, Ko-Kulturen zu etablieren. Der Chip wurde verwendet, um in weniger als 6 Stunden tausende von 3D-Zellaggregaten aus etwa 600 PPs zu bilden. In den folgenden 14 Tagen wurden die 3D-PP-Kulturen mit einem definierten Wachstumsfaktorprotokoll in pankreatische dukt-ähnliche Organoide differenziert. Zeitaufgelöste Einzelzell-Transkriptionsprofile und Immunfluoreszenz von gereinigten dukt-ähnlichen Organoiden der Bauchspeicheldrüse zeigten die Entstehung von zwei Arten von duktalen Vorläufern, Zwischenstufen, und reifen duktalen Zellen und wenigen nicht-duktalen Zelltypen. Entsprechende dynamische Transkriptionsstadien wiesen auf definierte Differenzierungsrouten der duktalen Zellen hin, die in zwei entweder CFTR+ oder Mucin+ Subpopulationen resultieren. Diese Subpopulationen wurden bereits in primären Einzelzelltranskriptomen des Pankreas gefunden[4]. Die Integration unseres Einzelzelldatensatzes mit drei primären Pankreasdatensätzen[4-6] zeigte, dass unsere dukt-ähnlichen Zellen zusammen mit primären duktalen Zellen zu den beiden Subpopulationen clustern. Außerdem konnten die Marker der Subpopulationen in einem reanalysierten Primärdatensatz[5] erneut identifiziert und in menschlichem Primärgewebe angefärbt werden. Darüber hinaus wurde die Duct-on-Chip-Plattform genutzt, um Organoid-Ko-Kulturen mit humanen Stellat-Zellen zu etablieren. Als zusätzliche Anwendung ermöglichte die Matrigel-freie Chip-Technologie die Entnahme des Sekretoms und Proteoms der Organoide. In Verbindung mit dem Einzelzell-Transkriptom und der klinischen Validierung ermöglichten uns diese Sekretomstudien die Entdeckung eines beispielhaften frühen PDAC-Marker namens FLNB, welcher sowohl in Biopsien als auch im peripheren Blut von Patienten im Frühstadium nachweisbar ist. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit die erfolgreiche Herstellung von Pankreas dukt-ähnlichen Organoiden aus hiPSCs, die ein Reifestadium aufweisen, welches mit dem des fötalen Pankreas vergleichbar ist. Durch die Kombination von zeitaufgelöster Einzelzelltranskriptomik mit verschiedenen Analysemethoden, Sekretomstudien, Proteomstudien und klinischer Validierung auf unserem Microwell-Chip wurde ein patientenspezifisches Duktmodell und ein potenzielles Krebsdiagnoseinstrument entwickelt.

Abstract

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the most severe diseases of the exocrine pancreas, for which relevant early diagnostic markers are still missing. To identify PDAC biomarkers, experimental models employing in vitro cultivation of exocrine pancreas models require as early as possible precancerous stages. The translation of pancreatic ductal differentiation of human pluripotent stem cells (hiPSCs) into in vitro disease models requires a comprehensive understanding of the developmental trajectories of pancreas-specific cell types. In this study, a microwell chip technology exhibiting defined microstructured patterns to assemble hiPSC-derived pancreatic progenitor cells (PP) into a 3-dimensional cell culture was developed. The advantages of the chip platform are i) the parallel formation of hundreds of equally sized 3D cell aggregates, ii) a Matrigel-free microenvironment, iii) the compatibility with high-resolution imaging, iv) simple applicability for several downstream analyses with minimal perturbation, and v) the possibility to establish co-cultures. The chip was used to generate thousands of 3D cell aggregates from approximately 600 PPs, in less than six hours. For the following 14 days, the 3D PP cultures were differentiated towards pancreatic ductal-like organoids by employing defined growth factor protocols. Time-resolved single-cell transcriptional profiling and immunofluorescence of cleared pancreatic duct-like organoids revealed the emergence of two types of ductal progenitors, intermediates, mature duct-like cells, and a few non-ductal cell types. Corresponding dynamic transcriptional stages indicated defined differentiation routes of duct-like cells, cumulating in two either CFTR+ or mucin+ subpopulations, which have been found before in primary single-cell transcriptomes of the pancreas[4]. The integration of the PDLO single-cell dataset into three primary pancreas datasets[4-6] showed that the duct-like cells clustered together with primary ductal cells into the two subpopulations. Furthermore, the markers of the subpopulations could be reidentified in a reanalyzed primary dataset[5] and subjected to confirmation by immunofluorescence in primary human tissue. Additionally, the duct-on-chip platform was exploited to establish organoid co-cultures with stellate cells. As an additional application, the Matrigel-free chip technology allowed the characterization of secretome and proteome. Together with the single-cell transcriptome and clinical validation, these secretome studies revealed an exemplary early PDAC marker, called FLNB, which is detectable in biopsies and early-stage patients' peripheral blood. In conclusion, this study reports the successful engineering of pancreatic duct-like organoids from hiPSCs, which show a maturation stage comparable to the fetal pancreas. By combining time-resolved single-cell transcriptomics with different analysis methods, secretome, proteome and clinical validation on our microwell chip, a patient-specific duct model and a potential cancer diagnostic tool was developed.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
• Fakultäten: Fakultät für Chemie und Pharmazie
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 23. September 2022
• 1. Bericht­erstatter:in: Uhlenhaut, Nina