Two L-histidine transporters and one sensor kinase

Wirtz, Larissa Marie Aniela (2022): Two L-histidine transporters and one sensor kinase: molecular mechanisms of regulation of histidine metabolism and transport in Pseudomonas putida KT2440. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie

Abstract

The Gram-negative soil bacterium Pseudomonas putida KT2440 colonizes the rhizosphere of plants and promotes their growth. It is genetically accessible, solvent-resistant and biosafe and therefore, serves as a platform for industrial biosyntheses (for example, plastic-like polymers and biosurfactants). The bacterium is metabolically extremely versatile and can utilize diverse nutrients as carbon and nitrogen sources. Two-component systems consisting of a sensor kinase and a response regulator play an important role in the adaptation of the cell metabolism to environmental and nutrient conditions. These regulatory systems control, among other things, the expression of genes encoding nutrient-specific transporters. The focus of this thesis is on the two-component system CbrA/CbrB and the transporter HutT of P. putida KT2440. CbrA/CbrB is a key regulatory system involved in catabolite repression and control of various catabolic pathways in other pseudomonads. Remarkably, in addition to sensor kinase-typical domains, the sensor kinase CbrA also contains a membrane-integral transporter domain that belongs to the solute:Na+ symporter family (SSSF). The physiological significance and molecular function of the SSSF domain of CbrA are unknown. HutT is also a protein localized in the cytoplasmic membrane and belongs to the amino acid transporter (AAT) family within the amino acid polyamine organocation (APC) transporter superfamily. The function of HutT in P. putida KT2440 has not been studied experimentally before. The task of this thesis was to elucidate the functional properties of CbrA/CbrB and HutT of P. putida KT2440. This investigation confirmed also for P. putida KT2440 that the CbrA/CbrB system is involved in catabolite repression by regulating the expression of the small RNA CrcZ. Furthermore, the two-component system controls the catabolism of basic amino acids such as histidine. For biochemical analyses, CbrA and CbrB of P. putida KT2440 were produced heterologously in Escherichia coli and purified. Experiments with cells and purified proteins revealed that CbrA can bind and transport histidine. The transport was found to be specific for histidine. The inhibition pattern obtained with ionophores suggests an electrochemical proton gradient as the driving force. The kinase domain was not required for the uptake of histidine by the SSSF domain of CbrA and did not significantly affect transport kinetics. In addition, the histidine kinase domain was experimentally shown to autophosphorylate and transfer the phosphoryl group to the response regulator CbrB. The SSSF domain was not essential for these activities but modulated autokinase activity. Phosphatase activity of CbrA was not detectable. None of the phosphotransfer activities are significantly affected by L-histidine. The results indicate that CbrA functions as an L-histidine transporter and sensor kinase in P. putida KT2440. For HutT, this thesis showed that deletion of the corresponding gene inhibited the growth of P. putida KT2440 on histidine. This suggests that the transporter plays a central role in the uptake of histidine in this bacterium. Transport experiments with cells and purified and reconstituted protein revealed that HutT is a histidine:H+ symporter. Analyses of histidine binding and transport kinetics, as well as competition experiments, showed that HutT is highly specific for histidine and binds it with high affinity. Substitutional analyses provided evidence for amino acids possibly involved in substrate binding or coupling of histidine transport to an electrochemical proton gradient. In summary, the sensor kinase CbrA plays a central role as a metabolic regulator and transports the amino acid histidine in P. putida KT2440. The physiological significance of this transport remains unclear. HutT, on the other hand, plays a central role in the uptake of histidine when the amino acid is used as a carbon source.

Abstract

Das Gram-negative Bodenbakterium Pseudomonas putida KT2440 besiedelt die Rhizosphäre von Pflanzen und fördert deren Wachstum. Es ist genetisch zugänglich, lösungsmittelbeständig, und biologisch sicher und dient deshalb als Plattform für industrielle Biosynthesen (zum Beispiel kunststoffähnliche Polymere und Biotenside). Das Bakterium ist metabolisch äusserst versatil und kann vielfältige Nährstoffe als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle nutzen. Bei der Anpassung des Stoffwechsels an Umwelt- und Nährstoffbedingungen spielen Zwei-Komponenten-Systeme bestehend aus einer Sensorkinase und einem Antwortregulator eine wichtige Rolle. Diese Regulationssysteme kontrollieren unter anderem die Expression von Genen, die für nährstoffspezifische Transporter kodieren. Im Mittelpunkunkt dieser Arbeit stehen das Zweitkomponenten-System CbrA/CbrB und der Transporter HutT von P. putida KT2440. CbrA/CbrB ist ein zentrales regulatorisches System, das in anderen Pseudomonaden unter anderem an der Katabolitrepression und an der Kontrolle verschiedener kataboler Stoffwechselwege beteiligt ist. Bemerkenswert ist, dass die Sensorkinase CbrA neben Sensorkinase-typischen Domänen auch eine membranintegrale Transporterdomäne enthält, die zur Substrat:Na+-Symporter-Familie (SSSF) gehört. Physiologische Bedeutung und molekulare Funktion der SSSF-Domäne von CbrA sind nicht bekannt. HutT ist ebenfalls ein in der Zytoplasmamembran lokalisiertes Protein, das innerhalb der Superfamilie der Aminosäure-Polyamin-Organokationen (APC) Transporter zur Aminosäuretransporter (AAT)-Familie gehört. Die Funktion von HutT in P. putida KT2440 wurde bisher noch nicht experimentell untersucht. Aufgabe der Arbeit war die Aufklärung der funktionellen Eigenschaften von CbrA/CbrB und HutT von P. putida KT2440. In dieser Arbeit wurde auch für P. putida KT2440 nachgewiesen, dass das CbrA/CbrB-System an der Katabolitrepression durch Regulierung der Expression der kleinen RNA CrcZ beteiligt ist. Weiterhin kontrolliert das Zweikomponenten-System den Katabolismus von basischen Aminosäuren wie zum Beispiel L-Histidin. Für biochemische Analysen wurden CbrA und CbrB von P. putida KT2440 heterolog in Escherichia coli produziert und gereinigt. Untersuchungen mit Zellen und gereinigten Proteinen zeigten, dass CbrA L-Histidin binden und transportieren kann. Der Transport erwies sich als spezifisch für L-Histidin. Das mit Ionophoren erhaltene Inhibitionsmuster wies auf einen elektrochemischen Protonengradienten als Triebkraft hin. Die Kinasedomäne war für die Aufnahme von L-Histidin durch die SSSF-Domäne von CbrA nicht erforderlich und hatte keinen wesentlichen Einfluss auf die Transportkinetik. Darüber hinaus wurde experimentell nachgewiesen, dass sich die Sensorkinase autophosphoryliert und die Phosphorylgruppe auf den Antwortregulator CbrB überträgt. Die SSSF-Domäne war für diese Aktivitäten nicht essentiell, modulierte aber die Autokinase-Aktivität. Eine Phosphataseaktivität von CbrA war nicht nachweisbar. Keine der Phosphotransferaktivitäten wird durch L-Histidin signifikant beeinflusst. Die Ergebnisse zeigen, dass CbrA als L-Histidin-Transporter und Sensorkinase in P. putida KT2440 fungiert. Für HutT wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die Deletion des entsprechenden Gens das Wachstum von P. putida KT2440 auf Histidin inhibiert. Dies deutet darauf hin, dass der Transporter eine zentrale Rolle bei der Aufnahme von Histidin in diesem Bakterium spielt. Transportexperimente mit Zellen und gereinigtem und rekonstituierten Protein ergaben, dass HutT ein Histidin:H+ -Symporter ist. Analysen von Histidinbindung und Transportkinetik sowie Kompetitionsexperimente zeigten, dass HutT hochspezifisch für Histidin ist und dieses mit hoher Affinität bindet. Durch Substitutionsanalysen wurden Hinweise auf Aminosäuren erhalten, die möglicherweise an der Substratbindung oder der Kopplung an einen elektrochemischen Protonengradienten beteiligt sind. Zusammenfassend ist festzustellen, dass die Sensorkinase CbrA in P. putida KT2440 eine zentrale Rolle als Stoffwechselregulator spielt und die Aminosäure Histidin transportiert. Die physiologische Bedeutung dieses Transports bleibt unklar. HutT hingegen spielt eine zentrale Rolle bei der Aufnahme von Histidin, wenn die Aminosäure als Kohlenstoffquelle genutzt wird.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: SSSF transporter, APC transporter, histidine, protein, Pseudomonas putida
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
• Fakultäten: Fakultät für Biologie
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 28. September 2022
• 1. Bericht­erstatter:in: Jung, Heinrich