Reprogramming Emesvirus zinderi

Wagner, Alexander (2022): Reprogramming Emesvirus zinderi: an approach to changing an RNA virus's behaviour. Dissertation, LMU München: Fakultät für Chemie und Pharmazie

Abstract

The genomes of all of today’s organisms are encoded in deoxyribonucleic acid (DNA). However, at the early stages of the emergence of life, ribonucleic acids (RNA) might have played a comparable role. Potential descendants of these ancient RNAs can be found in the form of RNA viruses, especially small single stranded RNA viruses. A well-studied example for these viruses is Emesvirus zinderi, more commonly known as bacteriophage MS2. In this study, the genome of MS2 served as a starting point for the design of an RNA based replisome, encoding for genetic information beyond the replicase gene. Furthermore, harnessing the infection mechanism of MS2, based on the MS2 maturation protein, it was tried in parallel to establish a new RNA delivery system. While these approaches are of interest for synthetic biology and biochemical technologies, they also might shed light on the role of RNA at the beginnings of life. Using classical biochemical and microbiological methods in combination with modern synthetic biology, a variety of tools could be established and repurposed for this endeavour. Deploying an in vitro translational system, used in synthetic biology, led to the identification of amino acids in the maturation protein crucial for viral infection, while classical methods for protein purification and detection of this infection enabled the in vitro reconstitution of minimal infectious units of MS2. Using the same translational system, sequential reduction/simplification of it led to the identification of the minimal complex for RNA replication and regulating co-factors. In addition, the characterisation of the replication machinery led to the discovery of novel RNA replicators, providing a platform for the design of RNA replisomes. These replisomes, similar in function to plasmid-based DNA replisomes, could be shown to be capable of in vitro replication and translation. Finally, during this thesis additional methods were established that exhibited potential for future studies of RNA replisomes, but also provide a strategy for replisome generation based on alternative viral systems. In conclusion, the goal of this study, the design of an RNA based replisome was achieved and this discovery opens new possible applications in the research fields of synthetic biology and the emergence of life.

Abstract

Die Genome aller heutigen Organismen sind in Desoxyribonukleinsäure (DNA) kodiert. In den frühen Stadien der Entstehung des Lebens könnten jedoch Ribonukleinsäuren (RNA) eine vergleichbare Rolle gespielt haben. Mögliche Nachfolger dieser ursprünglichen RNAs finden sich in Form von RNA-Viren, insbesondere kleinen einzelsträngigen RNA-Viren. Ein gut untersuchtes Beispiel für diese Viren ist Emesvirus zinderi, besser bekannt als Bakteriophage MS2. In dieser Studie diente das Genom von MS2 als Ausgangspunkt für den Entwurf eines RNA-basierten Replisoms, das für genetische Informationen über das Replikase-Gen hinaus kodiert. Ausserdem wurde unter Ausnutzung des Infektionsmechanismus von MS2, der auf dem MS2-Reifungsprotein basiert, parallel dazu versucht ein neues RNA-Transportsystem zu entwickeln. Diese Ansätze sind nicht nur für die synthetische Biologie und biochemische Technologien von Interesse, sondern könnten auch Aufschluss über die Rolle von RNA am Anfang des Lebens geben. Durch den Einsatz klassischer biochemischer und mikrobiologischer Methoden in Kombination mit der modernen synthetischen Biologie konnte eine Vielzahl von Werkzeugen für dieses Vorhaben etabliert und umgenutzt werden. Der Einsatz eines in der synthetischen Biologie verwendeten In-vitro-Translationssystems führte zur Identifizierung von Aminosäuren im Reifungsprotein, die für die virale Infektion entscheidend sind, während klassische Methoden zur Proteinaufreinigung und zum Nachweis dieser Infektion die In-vitro-Rekonstitution von minimalen infektiösen Einheiten von MS2 ermöglichten. Unter Verwendung desselben Translationssystems führte die sequenzielle Reduktion/Vereinfachung desselben zur Identifizierung der essenziellen Proteinfaktoren für die RNA-Replikation und zusätzlicher regulierender Co-Faktoren. Darüber hinaus führte die Charakterisierung der Replikationsmaschinerie zur Entdeckung neuartiger RNA-Replikatoren, die eine Plattform für den Entwurf von selbstreplizierenden RNA-Vektoren bildeten. Diese Replisomen, die in ihrer Funktion den plasmidbasierten DNA-Replisomen ähneln, waren nachweislich in der Lage in vitro zu replizieren und translatiert zu werden. Schließlich wurden im Rahmen dieser Arbeit zusätzliche Methoden etabliert, die Potenzial für künftige Untersuchungen von RNA Replisomen aufweisen, aber auch eine Strategie für die Erzeugung von Replisomen auf Basis anderer viraler Systeme bieten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Ziel dieser Studie, die Entwicklung eines RNAbasierten Replisoms, erreicht wurde und diese Entdeckung neue Anwendungsmöglichkeiten in den Forschungsbereichen der synthetischen Biologie und der Entstehung des Lebens eröffnet.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: RNA virus, Self-replicating RNA, Synthetic Biology, RNA world
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
• Fakultäten: Fakultät für Chemie und Pharmazie
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 11. August 2022
• 1. Bericht­erstatter:in: Förstemann, Klaus