Identification of substrate requirements for γ-secretase cleavage of the amyloid precursor protein

Werner, Nadine Tamara (2022): Identification of substrate requirements for γ-secretase cleavage of the amyloid precursor protein. Dissertation, LMU München: Graduate School of Systemic Neurosciences (GSN)

Abstract

Intramembrane proteolysis is of vital importance for numerous cellular processes and its dysfunction has repeatedly been associated with various diseases, such as Alzheimer’s disease (AD) and cancer. γ-Secretase is an intramembrane-cleaving protease complex involved in the production of the amyloid-β peptide (Aβ), one of the neuropathological hallmarks of AD. To date, a vast number of γ secretase substrates have been identified with C99, the precursor of Aβ, being one of the best studied substrates. Yet, despite recent advances in the field, the factors determining substrate recognition and efficient cleavage remain largely elusive. No specific consensus sequence motif for the discrimination between substrates and non substrates is currently known to exist. However, several lines of evidence suggested that the presence of a flexible region (e.g., a glycine-glycine (GG)-hinge motif) within the transmembrane domain (TMD) of a substrate might be critical for substrate recruitment and cleavage by γ secretase and intramembrane proteases in general, although, conflicting data existed. The cleavage of a γ-secretase substrate (substrate processing) can be divided into two stages: the initial cleavage and the subsequent trimming, also referred to as processivity. To illuminate the principles of substrate recognition and cleavage by γ-secretase, this thesis combined biophysical studies with biochemical data on the cleavability of various C99-based constructs. The work presented here, demonstrated that the GG-hinge motif in C99 conveys a flexibility necessary for the interaction with γ-secretase. A certain flexibility appears to be critical for the translocation from the exosites (distal binding sites) to the active site and correct positioning of the scissile bond at the active site. Indeed, the presence of a flexible motif in the N terminal half of the TMD (TM N) of C99 proved to be a sufficient substrate requirement for cleavage of C99 and may even be a substrate requirement for a subgroup of γ secretase substrates. The cleavage region, in the C terminal TMD (TM-C), turned out to be equally important for substrate cleavage by γ secretase. It appears that specific interactions between the substrate’s TM-C and the enzyme are far more important than a flexible motif in this region of C99. It is possible, that the TM C is vital for docking of the scissile bond at the active center, as well as for the formation of a β sheet, which has been shown to stabilize the substrate and to bring the scissile bond into position. Intriguingly, both the flexible motif and the cleavage region must cooperate to enable efficient cleavage of C99. After the initial cleavage, however, a helical TMD promoted further trimming. Altogether, these data indicate that cleavage of C99 is determined by the presence of a flexible region in the TM N, facilitating the translocation to the active site, and the cleavage region in the TM-C, crucial for the formation of a cleavage competent state, while a helical TMD is required for efficient trimming. Overall, this work further illuminated the principles of substrate recognition and cleavage by γ secretase, helping to advance our understanding of the structurally and functionally most complex intramembrane protease known.

Abstract

Die Intramembranproteolyse ist für zahlreiche grundlegende zelluläre Prozesse von entscheidender Bedeutung. Eine Dysfunktion dieses Prozesses wurde bereits mehrfach mit verschiedenen Krankheiten, wie der Alzheimer-Krankheit (AK) und Krebs, in Verbindung gebracht. Die γ Sekretase ist eine Intramembranprotease, welche an der Produktion von Aβ, Hauptbestandteil eines der neuropathologischen Merkmale der AK, beteiligt ist. Bis heute wurde eine Vielzahl von γ Sekretase Substraten identifiziert, wobei C99, das Vorläuferprotein von Aβ, eines der am besten untersuchten Substrate darstellt. Jedoch sind, trotz der jüngsten Fortschritte auf dem Gebiet der γ Sekretase Forschung, die Faktoren, die für die Erkennung und effiziente Spaltung der Substrate ausschlaggebend sind, nach wie vor weitgehend unbekannt. So wurde bisher kein spezifisches Erkennungsmotiv für die Unterscheidung von Substraten und Nicht-Substraten identifiziert. Diverse Hinweise deuten jedoch darauf hin, dass das Vorhandensein einer flexiblen Region (z. B.: ein Glycin Glycin- (GG ) Scharnier-Motiv) innerhalb der Transmembrandomäne (TMD) eines Substrats entscheidend für die Spaltung durch die γ Sekretase, und Intramembranproteasen im Allgemeinen, sein könnte. Die Datenlage bezüglich der Rolle einer flexiblen TMD für die Substratspaltung war allerdings nicht eindeutig. Die Spaltung eines γ-Sekretase-Substrats (Prozessierung) kann in zwei Abschnitte unterteilt werden: die initiale endoproteolytische Spaltung und die anschließende carboxyterminale Spaltung. Um die Prinzipien der Substraterkennung und -spaltung durch die γ-Sekretase besser verstehen zu können, wurden in dieser Arbeit biophysikalische Analysen mit biochemischen Daten zur Spaltbarkeit verschiedener C99 basierter Konstrukte kombiniert. Die hier vorgestellten Ergebnisse machen deutlich, dass das GG Motiv in C99 eine für die Interaktion zwischen dem Substrat und der γ Sekretase notwendige Flexibilität vermittelt. Eine gewisse Flexibilität scheint für die Translokation von den „Exosites“ (Bindestellen abseits des aktiven Zentrums) hin zu dem aktiven Zentrum, sowie die korrekte Positionierung der zu spaltenden Peptidbindung in dem aktiven Zentrum der γ-Sekretase entscheidend zu sein. Tatsächlich erwies sich das Vorhandensein eines flexiblen Motivs in dem N-terminalen Teil der TMD (TM N) von C99 als hinreichende Substratanforderung für die Spaltung durch die γ Sekretase. Möglicherweise stellt ein solches Motiv sogar eine Substratanforderung für eine Untergruppe von γ-Sekretase Substraten dar. Der C terminale Teil der Spaltregion, lokalisiert in der C terminalen Hälfte der TMD (TM-C), erwies sich als ebenso essenziell für die Spaltung durch die γ Sekretase. Es scheint, dass spezifische Interaktionen zwischen dem TM-C von C99 und dem Enzym viel wichtiger sind als ein flexibles Motiv in dieser Region des Substrats. Möglicherweise ist die TM-C entscheidend für das Andocken der zu spaltenden Bindung an das aktive Zentrum, sowie für die Bildung eines β-Faltblattes, welches das Substrat stabilisiert und die zu spaltende Bindung in Position bringt. Interessanterweise war ein Zusammenspiel zwischen dem flexiblen Motiv und der natürlichen Spaltregion notwendig, um eine effiziente Spaltung von C99 zu ermöglichen. Die weitere carboxyterminale Spaltung des Substrats, die im Anschluss an die initiale Spaltung erfolgt, wurde hingegen durch eine helikale Konformation der TMD des Substrats begünstigt. Folglich wird die Spaltung von C99 durch das Vorhandensein einer flexiblen Region im TM-N, welche die Translokation zum aktiven Zentrum ermöglicht, und der natürlichen Spaltregion im TM C, welche für die Positionierung des Substrats wichtig ist, bestimmt. Während eine helikale TMD für eine effiziente carboxyterminale Spaltung erforderlich ist. Insgesamt hat diese Arbeit dazu beigetragen, die Prinzipien der Substraterkennung und -spaltung durch die γ Sekretase aufzuklären und unser Verständnis der strukturell und funktionell komplexesten, bekannten Intramembranprotease, voranzutreiben.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
• Fakultäten: Graduate School of Systemic Neurosciences (GSN)
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 14. Juli 2022
• 1. Bericht­erstatter:in: Steiner, Harald