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Nachweis von toxinogenen Isolaten von Stachybotrys chartarum mit einem Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) – Assay
Nachweis von toxinogenen Isolaten von Stachybotrys chartarum mit einem Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) – Assay
Der ubiquitär verbreitete Schimmelpilz S. chartarum stellt für die Gesundheit von Menschen (Etzel, 2003; Johanning und Yang, 1994) und Tieren (Forgacs et al., 1958) durch sein toxisches Potenzial eine Bedrohung dar. Die besonders zytotoxischen makrozyklischen Trichothecene (Jarvis et al., 1995) können nur vom Chemotyp S dieses Pilzes synthetisiert werden. Die harmloseren Varianten dieser Schimmelpilzart können rein morphologisch (kulturell/mikroskopisch) nicht vom Chemotyp S unterschieden werden. Determiniert wird dieser toxische Chemotyp durch seine genetische Ausstattung, nämlich der Präsenz des kompletten Satratoxin-Clusters (SC 1-3) (Semeiks et al., 2014; Ulrich et al., 2019). Diese 21 SAT-Gene sind für die Fähigkeit zur Biosynthese von Satratoxinen essentiell und ermöglichen die Unterscheidung zwischen drei Genotypen in S. chartarum. Der Genotyp S repräsentiert den Chemotyp S, der in der Lage ist Satratoxine und andere hochtoxische makrozyklische Trichothecene zu produzieren, der Genotyp A und der erst kürzlich beschriebene Genotyp H repräsentieren den Chemotyp A, der Atranone produzieren kann (Ulrich et al., 2019). Die Gene sat11 bis sat16 konnten nur in Isolaten von S. chartarum gefunden werden, die bei Anzucht makrozyklische Trichothecene produzierten. In der vorliegenden Arbeit wurde eine gegenüber der PCR alternative Nukleinsäureamplifika-tionstechnik verwendet, die loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Bei dieser Methode wird unter Verwendung von vier Oligonucleotid Primern unter isothermalen Bedingungen innerhalb einer Stunde die Ziel-DNA amplifiziert (Notomi et al., 2015; Notomi et al., 2000). Die Ergebnisauswertung erfolgt durch einen Farbumschlag von gelb nach rosa und ist mit blo-ßem Auge abzulesen, ohne das Mikroreaktionsgefäß öffnen zu müssen. Unter den möglichen Ziel-Genen (sat11 – sat16) für den Nachweis des Chemotyp S in S. chartarum per LAMP wurde sat14 ausgewählt, da es im Vergleich am wenigsten Introns, Basenfehlpaarungen und Einzel-nukleotid-Polymorphismen (SNP) enthält. In dieser Arbeit wurde die DNA von 227 Schimmelpilzen mit LAMP analysiert, wobei alle 30 Chemotyp S (Genotyp S) Isolate der insgesamt 75 S. chartarum Stämme positiv detektiert wurden und keine Kreuzrektionen mit DNA von anderen Schimmelpilzen auftraten. Diese Ergebnisse lassen den Nachweis von S. chartarum Chemotyp S mit der zeit- und kosteneffektiven LAMP Methode zu einem vielversprechenden diagnostischem Werkzeug in der Überwachung der menschlichen und tierischen Gesundheit werden., The ubiquitous mold S. chartarum poses a threat to human (Etzel, 2003; Johanning und Yang, 1994) and animal (Forgacs et al., 1958) health due to its toxic potential. Only the chemotype S is able to synthesize the strong cytotoxic macrocyclic trichothecenes (Jarvis et al., 1995). The far more harmless variants of this mold cannot be distinguished from the chemotype S morphologically (by culture/microscopic). This toxic chemotype is determined by its genetic makeup - the presence of the complete satratoxin cluster (SC 1-3) (Semeiks et al., 2014; Ulrich et al., 2019). These 21 SAT genes are essential for the ability to biosynthesize satratoxins and enable the distinction between the three genotypes in S. chartarum. Genotype S represents the chemotype S, which is able to produce satratoxins and other highly toxic macrocyclic trichothecenes, the genotype A and the recently described genotype H represent the chemotype A, which produces atranones as mycotoxins (Ulrich et al., 2019). The genes sat11 to sat16 are exclusively present in isolates of S. chartarum which produced macrocyclic trichothecenes in culture. Detection methods such as the polymerase chain reaction (PCR) are time-consuming and expensive. In the present work an alternative nucleic acid amplification technique was used, the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) (Notomi et al., 2015; Notomi et al., 2000). In this method, the target DNA is amplified within one hour using four oligonucleotide primers under isothermal conditions. The results are shown by a color change from yellow to pink and can be read with the naked eye without opening the reaction vessel. Among the possible target genes (sat11 - sat16), sat14 was used for the detection of chemotype S by LAMP, because in comparison it contains the fewest introns, mismatches and single nucleotide polymorphisms (SNP). In this work, the DNA of 227 molds was analyzed with LAMP. All 30 chemotype (genotype) S among the 75 S. chartarum isolates were positively detected and no cross-reactions with DNA from other fungi occurred. These results make the detection of S. chartarum chemotype S with the time- and costeffective LAMP method a promising diagnostic tool in the monitoring of human and animal health.
Stachybotryotoxicosis, Sick building syndrome, Indoor air quality, Water damage, sat14 gene
Köck, Johannes Michael
2022
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Köck, Johannes Michael (2022): Nachweis von toxinogenen Isolaten von Stachybotrys chartarum mit einem Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) – Assay. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Der ubiquitär verbreitete Schimmelpilz S. chartarum stellt für die Gesundheit von Menschen (Etzel, 2003; Johanning und Yang, 1994) und Tieren (Forgacs et al., 1958) durch sein toxisches Potenzial eine Bedrohung dar. Die besonders zytotoxischen makrozyklischen Trichothecene (Jarvis et al., 1995) können nur vom Chemotyp S dieses Pilzes synthetisiert werden. Die harmloseren Varianten dieser Schimmelpilzart können rein morphologisch (kulturell/mikroskopisch) nicht vom Chemotyp S unterschieden werden. Determiniert wird dieser toxische Chemotyp durch seine genetische Ausstattung, nämlich der Präsenz des kompletten Satratoxin-Clusters (SC 1-3) (Semeiks et al., 2014; Ulrich et al., 2019). Diese 21 SAT-Gene sind für die Fähigkeit zur Biosynthese von Satratoxinen essentiell und ermöglichen die Unterscheidung zwischen drei Genotypen in S. chartarum. Der Genotyp S repräsentiert den Chemotyp S, der in der Lage ist Satratoxine und andere hochtoxische makrozyklische Trichothecene zu produzieren, der Genotyp A und der erst kürzlich beschriebene Genotyp H repräsentieren den Chemotyp A, der Atranone produzieren kann (Ulrich et al., 2019). Die Gene sat11 bis sat16 konnten nur in Isolaten von S. chartarum gefunden werden, die bei Anzucht makrozyklische Trichothecene produzierten. In der vorliegenden Arbeit wurde eine gegenüber der PCR alternative Nukleinsäureamplifika-tionstechnik verwendet, die loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Bei dieser Methode wird unter Verwendung von vier Oligonucleotid Primern unter isothermalen Bedingungen innerhalb einer Stunde die Ziel-DNA amplifiziert (Notomi et al., 2015; Notomi et al., 2000). Die Ergebnisauswertung erfolgt durch einen Farbumschlag von gelb nach rosa und ist mit blo-ßem Auge abzulesen, ohne das Mikroreaktionsgefäß öffnen zu müssen. Unter den möglichen Ziel-Genen (sat11 – sat16) für den Nachweis des Chemotyp S in S. chartarum per LAMP wurde sat14 ausgewählt, da es im Vergleich am wenigsten Introns, Basenfehlpaarungen und Einzel-nukleotid-Polymorphismen (SNP) enthält. In dieser Arbeit wurde die DNA von 227 Schimmelpilzen mit LAMP analysiert, wobei alle 30 Chemotyp S (Genotyp S) Isolate der insgesamt 75 S. chartarum Stämme positiv detektiert wurden und keine Kreuzrektionen mit DNA von anderen Schimmelpilzen auftraten. Diese Ergebnisse lassen den Nachweis von S. chartarum Chemotyp S mit der zeit- und kosteneffektiven LAMP Methode zu einem vielversprechenden diagnostischem Werkzeug in der Überwachung der menschlichen und tierischen Gesundheit werden.

Abstract

The ubiquitous mold S. chartarum poses a threat to human (Etzel, 2003; Johanning und Yang, 1994) and animal (Forgacs et al., 1958) health due to its toxic potential. Only the chemotype S is able to synthesize the strong cytotoxic macrocyclic trichothecenes (Jarvis et al., 1995). The far more harmless variants of this mold cannot be distinguished from the chemotype S morphologically (by culture/microscopic). This toxic chemotype is determined by its genetic makeup - the presence of the complete satratoxin cluster (SC 1-3) (Semeiks et al., 2014; Ulrich et al., 2019). These 21 SAT genes are essential for the ability to biosynthesize satratoxins and enable the distinction between the three genotypes in S. chartarum. Genotype S represents the chemotype S, which is able to produce satratoxins and other highly toxic macrocyclic trichothecenes, the genotype A and the recently described genotype H represent the chemotype A, which produces atranones as mycotoxins (Ulrich et al., 2019). The genes sat11 to sat16 are exclusively present in isolates of S. chartarum which produced macrocyclic trichothecenes in culture. Detection methods such as the polymerase chain reaction (PCR) are time-consuming and expensive. In the present work an alternative nucleic acid amplification technique was used, the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) (Notomi et al., 2015; Notomi et al., 2000). In this method, the target DNA is amplified within one hour using four oligonucleotide primers under isothermal conditions. The results are shown by a color change from yellow to pink and can be read with the naked eye without opening the reaction vessel. Among the possible target genes (sat11 - sat16), sat14 was used for the detection of chemotype S by LAMP, because in comparison it contains the fewest introns, mismatches and single nucleotide polymorphisms (SNP). In this work, the DNA of 227 molds was analyzed with LAMP. All 30 chemotype (genotype) S among the 75 S. chartarum isolates were positively detected and no cross-reactions with DNA from other fungi occurred. These results make the detection of S. chartarum chemotype S with the time- and costeffective LAMP method a promising diagnostic tool in the monitoring of human and animal health.