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High-resolution single-molecule spectroscopy to probe conformational dynamics of proteins
High-resolution single-molecule spectroscopy to probe conformational dynamics of proteins
Fluorescence spectroscopy and microscopy are indispensable tools in numerous research fields and modern medicine, including molecular biology, biophysics, and biochemistry. Applications stretch from microscopy and spectroscopy with single molecule detection to sensor technology and the development of novel fluorescent probes. This work contribute to a fundamental investigation and spectroscopic characterization of established as well as newly available fluorescent probes for single-molecule microscopy. Furthermore, the development of quantitative single-molecule fluorescence measurements enables a systematic assay design and standardized measurement routines for quantitative measurements of protein conformation and dynamics. In this thesis, I focus on the design and analysis of solution-based single-molecule experiments of Förster resonance energy transfer (FRET) via confocal microscopy to study the dynamics of multiple binding proteins as exemplary biological systems. As the basis for high-quality fluorescence measurements, the widely used class of cyanine fluorophores is investigated with optical spectroscopy, mass spectrometry, and NMR spectroscopy. I conducted a comprehensive comparison between Alexa Fluor and AF dyes by continuous-wave absorption and emission spectroscopy, determination of quantum yield, fluorescence lifetime and anisotropy spectroscopy of free and protein-attached dyes to understand the impact of the location of negatively charged sulfonated groups on the overall photophysical behavior and its implications for single-molecule FRET (smFRET) measurements. In order to unravel photophysical effects from biological findings, pulsed electron-electron double resonance spectroscopy is used as a complementary technique to FRET for the investigation of protein conformation by the attachment of - in this case - spin labels. A comparison of the current limitations and advantages of both methods is conducted for multiple protein systems, which undergo conformational changes on different timescales. I compared measured distances to distance predictions from coarse-grained structural models and identified areas for further improvements in terms of label site and fluorophore selection. To further increase the reliability of FRET-derived distances and distance uncertainties in proteins, I conducted a blind study comprising 19 labs, which confirms the ability of smFRET to discover conformational dynamics on different timescales from sub-milliseconds to seconds and quantify the limits of distance accuracies for stochastic labeling of proteins. Further, I provide a detailed overview of the established routines in smFRET measurements for distance and dynamics measurements and determine the limitations of FRET-derived distances to a distance precision of ≤2 Å and an accuracy ≤5 Å. I identified the selection of fluorophores and labeling sites on the protein under investigation as limiting factor for the quality and significance of the findings in the experimental studies. Therefore, I established a theoretical framework for the assay design using basic probability theory. To do so, I exploited the results of more than 100 publications to identify the most relevant parameters for successful single-molecule fluorescence experiments and to introduce a scoring system for the selection. I implemented the analysis as stand-alone software package and open-access webserver to provide access to the analysis framework to all researchers in the field. The results are backed up with an experimental validation on a few exemplary protein systems., Fluoreszenzspektroskopie und -mikroskopie sind unverzichtbare Methoden in zahlreichen Forschungsbereichen und der modernen Medizin, einschließlich Molekularbiologie, Biophysik und Biochemie. Die Anwendungen reichen von der Mikroskopie und Spektroskopie mit Einzelmoleküldetektion bis zur Sensorik und der Entwicklung neuartiger fluoreszenter Proben. Diese Arbeit trägt zur grundlegenden Untersuchung und spektroskopischen Charakterisierung etablierter sowie neu verfügbarer fluoreszierender Proben für die Einzelmolekülmikroskopie bei. Darüber hinaus ermöglicht die Entwicklung von quantitativen Einzelmolekül-Fluoreszenzmessungen ein systematisches Versuchsdesign und standardisierte Messroutinen für quantitative Messungen der Proteinkonformation und -dynamik. In dieser Arbeit konzentriere ich mich auf das Design und die Analyse von lösungsbasierten Einzelmolekülexperimenten des Förster-Resonanz-Energie-Transfers (FRET) mittels konfokaler Mikroskopie, um die Dynamik von mehreren Bindeproteinen als exemplarische biologische Systeme zu untersuchen. Als Grundlage für qualitativ hochwertige Fluoreszenzmessungen wird die weit verbreitete Klasse der Cyanin-Fluorophore mit optischer Spektroskopie, Massenspektrometrie und NMR-Spektroskopie untersucht. Ich habe einen umfassenden Vergleich zwischen Alexa-Fluor- und AF-Farbstoffen mittels kontinuierlicher Absorptions- und Emissionsspektroskopie, Bestimmung der Quantenausbeute, der Fluoreszenzlebensdauer und Anisotropie-Spektroskopie von freien und an Proteine gebundenen Farbstoffen durchgeführt, um die Auswirkungen der Position von negativ geladenen sulfonierten Gruppen auf das gesamte photophysikalische Verhalten und deren Auswirkungen auf Einzelmolekül-FRET-Messungen (smFRET) zu verstehen. Um photophysikalische Einflüsse von biologischen Vorgängen zu trennen, wird die gepulste Elektronen-Elektronen-Doppelresonanzspektroskopie als komplementäre Technik zu FRET für die Untersuchung der Proteinkonformation durch die Anbringung von - in diesem Fall - Spin-Markern eingesetzt. Ein Vergleich der derzeitigen Limitierungen und Vorzüge beider Methoden wird für mehrere Proteinsysteme durchgeführt, die Konformationsänderungen auf unterschiedlichen Zeitskalen aufweisen. Ich habe gemessene Abstände mit den Abstandsvorhersagen aus grobkörnigen Strukturmodellen verglichen und Bereiche für weitere Verbesserungen in Bezug auf die Auswahl der Markierungsstellen und Fluorophore identifiziert. Um die Zuverlässigkeit von mit FRET bestimmten Abständen und Abstandsunsicherheiten bei Proteinen weiter zu erhöhen, habe ich eine Blindstudie mit 19 Laboren durchgeführt, die die Fähigkeit von smFRET bestätigt, die Konformationsdynamik auf verschiedenen Zeitskalen von Submillisekunden bis zu Sekunden aufzudecken und die Grenzen der Abstandsgenauigkeit bei stochastischer Markierung von Proteinen zu quantifizieren. Darüber hinaus gebe ich einen detaillierten Überblick über die etablierten Routinen bei smFRET-Messungen für Abstands- und Dynamikmessungen und bestimme die Grenzen der von FRET abgeleiteten Abstände auf eine Abstandsgenauigkeit von ≤2 Å und eine Genauigkeit ≤5 Å. Ich habe die Auswahl der Fluorophore und der Markierungsstellen auf dem zu untersuchenden Protein als limitierenden Faktor für die Qualität und Aussagekraft der Ergebnisse in den experimentellen Studien identifiziert. Aus diesem Grund habe ich einen theoretischen Ansatz für das Studiendesign unter Verwendung der grundlegenden Wahrscheinlichkeitstheorie entwickelt. Dazu habe ich die Ergebnisse von mehr als 100 Veröffentlichungen ausgewertet, um die wichtigsten Parameter für erfolgreiche Einzelmolekül-Fluoreszenzexperimente zu ermitteln und ein Punktesystem für die Auswahl einzuführen. Ich habe die Analyse als eigenständiges Softwarepaket und als frei zugänglichen Webserver implementiert, um allen Forschern auf diesem Gebiet Zugang zu dem Analyseverfahren zu ermöglichen. Die Ergebnisse werden durch eine experimentelle Validierung an einigen beispielhaften Proteinsystemen untermauert.
Not available
Gebhardt, Christian
2022
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Gebhardt, Christian (2022): High-resolution single-molecule spectroscopy to probe conformational dynamics of proteins. Dissertation, LMU München: Faculty of Physics
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Abstract

Fluorescence spectroscopy and microscopy are indispensable tools in numerous research fields and modern medicine, including molecular biology, biophysics, and biochemistry. Applications stretch from microscopy and spectroscopy with single molecule detection to sensor technology and the development of novel fluorescent probes. This work contribute to a fundamental investigation and spectroscopic characterization of established as well as newly available fluorescent probes for single-molecule microscopy. Furthermore, the development of quantitative single-molecule fluorescence measurements enables a systematic assay design and standardized measurement routines for quantitative measurements of protein conformation and dynamics. In this thesis, I focus on the design and analysis of solution-based single-molecule experiments of Förster resonance energy transfer (FRET) via confocal microscopy to study the dynamics of multiple binding proteins as exemplary biological systems. As the basis for high-quality fluorescence measurements, the widely used class of cyanine fluorophores is investigated with optical spectroscopy, mass spectrometry, and NMR spectroscopy. I conducted a comprehensive comparison between Alexa Fluor and AF dyes by continuous-wave absorption and emission spectroscopy, determination of quantum yield, fluorescence lifetime and anisotropy spectroscopy of free and protein-attached dyes to understand the impact of the location of negatively charged sulfonated groups on the overall photophysical behavior and its implications for single-molecule FRET (smFRET) measurements. In order to unravel photophysical effects from biological findings, pulsed electron-electron double resonance spectroscopy is used as a complementary technique to FRET for the investigation of protein conformation by the attachment of - in this case - spin labels. A comparison of the current limitations and advantages of both methods is conducted for multiple protein systems, which undergo conformational changes on different timescales. I compared measured distances to distance predictions from coarse-grained structural models and identified areas for further improvements in terms of label site and fluorophore selection. To further increase the reliability of FRET-derived distances and distance uncertainties in proteins, I conducted a blind study comprising 19 labs, which confirms the ability of smFRET to discover conformational dynamics on different timescales from sub-milliseconds to seconds and quantify the limits of distance accuracies for stochastic labeling of proteins. Further, I provide a detailed overview of the established routines in smFRET measurements for distance and dynamics measurements and determine the limitations of FRET-derived distances to a distance precision of ≤2 Å and an accuracy ≤5 Å. I identified the selection of fluorophores and labeling sites on the protein under investigation as limiting factor for the quality and significance of the findings in the experimental studies. Therefore, I established a theoretical framework for the assay design using basic probability theory. To do so, I exploited the results of more than 100 publications to identify the most relevant parameters for successful single-molecule fluorescence experiments and to introduce a scoring system for the selection. I implemented the analysis as stand-alone software package and open-access webserver to provide access to the analysis framework to all researchers in the field. The results are backed up with an experimental validation on a few exemplary protein systems.

Abstract

Fluoreszenzspektroskopie und -mikroskopie sind unverzichtbare Methoden in zahlreichen Forschungsbereichen und der modernen Medizin, einschließlich Molekularbiologie, Biophysik und Biochemie. Die Anwendungen reichen von der Mikroskopie und Spektroskopie mit Einzelmoleküldetektion bis zur Sensorik und der Entwicklung neuartiger fluoreszenter Proben. Diese Arbeit trägt zur grundlegenden Untersuchung und spektroskopischen Charakterisierung etablierter sowie neu verfügbarer fluoreszierender Proben für die Einzelmolekülmikroskopie bei. Darüber hinaus ermöglicht die Entwicklung von quantitativen Einzelmolekül-Fluoreszenzmessungen ein systematisches Versuchsdesign und standardisierte Messroutinen für quantitative Messungen der Proteinkonformation und -dynamik. In dieser Arbeit konzentriere ich mich auf das Design und die Analyse von lösungsbasierten Einzelmolekülexperimenten des Förster-Resonanz-Energie-Transfers (FRET) mittels konfokaler Mikroskopie, um die Dynamik von mehreren Bindeproteinen als exemplarische biologische Systeme zu untersuchen. Als Grundlage für qualitativ hochwertige Fluoreszenzmessungen wird die weit verbreitete Klasse der Cyanin-Fluorophore mit optischer Spektroskopie, Massenspektrometrie und NMR-Spektroskopie untersucht. Ich habe einen umfassenden Vergleich zwischen Alexa-Fluor- und AF-Farbstoffen mittels kontinuierlicher Absorptions- und Emissionsspektroskopie, Bestimmung der Quantenausbeute, der Fluoreszenzlebensdauer und Anisotropie-Spektroskopie von freien und an Proteine gebundenen Farbstoffen durchgeführt, um die Auswirkungen der Position von negativ geladenen sulfonierten Gruppen auf das gesamte photophysikalische Verhalten und deren Auswirkungen auf Einzelmolekül-FRET-Messungen (smFRET) zu verstehen. Um photophysikalische Einflüsse von biologischen Vorgängen zu trennen, wird die gepulste Elektronen-Elektronen-Doppelresonanzspektroskopie als komplementäre Technik zu FRET für die Untersuchung der Proteinkonformation durch die Anbringung von - in diesem Fall - Spin-Markern eingesetzt. Ein Vergleich der derzeitigen Limitierungen und Vorzüge beider Methoden wird für mehrere Proteinsysteme durchgeführt, die Konformationsänderungen auf unterschiedlichen Zeitskalen aufweisen. Ich habe gemessene Abstände mit den Abstandsvorhersagen aus grobkörnigen Strukturmodellen verglichen und Bereiche für weitere Verbesserungen in Bezug auf die Auswahl der Markierungsstellen und Fluorophore identifiziert. Um die Zuverlässigkeit von mit FRET bestimmten Abständen und Abstandsunsicherheiten bei Proteinen weiter zu erhöhen, habe ich eine Blindstudie mit 19 Laboren durchgeführt, die die Fähigkeit von smFRET bestätigt, die Konformationsdynamik auf verschiedenen Zeitskalen von Submillisekunden bis zu Sekunden aufzudecken und die Grenzen der Abstandsgenauigkeit bei stochastischer Markierung von Proteinen zu quantifizieren. Darüber hinaus gebe ich einen detaillierten Überblick über die etablierten Routinen bei smFRET-Messungen für Abstands- und Dynamikmessungen und bestimme die Grenzen der von FRET abgeleiteten Abstände auf eine Abstandsgenauigkeit von ≤2 Å und eine Genauigkeit ≤5 Å. Ich habe die Auswahl der Fluorophore und der Markierungsstellen auf dem zu untersuchenden Protein als limitierenden Faktor für die Qualität und Aussagekraft der Ergebnisse in den experimentellen Studien identifiziert. Aus diesem Grund habe ich einen theoretischen Ansatz für das Studiendesign unter Verwendung der grundlegenden Wahrscheinlichkeitstheorie entwickelt. Dazu habe ich die Ergebnisse von mehr als 100 Veröffentlichungen ausgewertet, um die wichtigsten Parameter für erfolgreiche Einzelmolekül-Fluoreszenzexperimente zu ermitteln und ein Punktesystem für die Auswahl einzuführen. Ich habe die Analyse als eigenständiges Softwarepaket und als frei zugänglichen Webserver implementiert, um allen Forschern auf diesem Gebiet Zugang zu dem Analyseverfahren zu ermöglichen. Die Ergebnisse werden durch eine experimentelle Validierung an einigen beispielhaften Proteinsystemen untermauert.