Purinergic signalling in testicular peritubular cells

Missel, Annika (2022): Purinergic signalling in testicular peritubular cells. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie

Abstract

Extracellular ATP and its metabolites, as part of the purinergic signalling system, act via membrane receptors and fulfil important roles in the body. However, in the testis this signalling system is still poorly examined, but evidence for paracrine communication is increasing. Spermatogenesis takes place in the seminiferous tubules, which are surrounded by smooth-muscle like peritubular cells. The physiologic principles of luminal transport through the testis were so far unknown. The present study, now, indicates that extracellular ATP, acting through P2 receptor-dependent pathways, is a physiological trigger of contractile forces in peritubular cells, resulting in sperm transport. Adenosine is the final metabolite of ATP, can act via adenosine receptors, and was found to be a pro-inflammatory molecule in the human testis. In human testicular peritubular cells (HTPCs), adenosine receptors as well as the ectonucleotidases CD39 and CD73, which can generate adenosine, are present in situ and in vtro. A malachite green assay, measuring free phosphate, identified both ectonucleotidases as being able to dephosphorylate extracellular ATP into its metabolites. Pharmacological inhibition of CD39 reduced not only the formation of extracellular phosphate, but also decreased pro-inflammatory cytokine levels, which were evoked after ATP exposure. Indeed, adenosine and its analogues elevated pro-inflammatory cytokines. Further studies, including a siRNA-mediated knock-down, identified the adenosine receptor A2B as the main mediator for adenosine-evoked production of pro-inflammatry cytokines in peritubular cells. HTPCs are primary cells and their use is limited due to availability, heterogeneity and replicative senescence in vitro. Therefore, peritubular cells from the common marmoset monkey, callithrix jacchus, (MKTPCs) were immortalized with a piggyBac transposon containing the human telomerase gene hTERT. The generated iMTKPCs retained their phenotype after immortalization and grew continuously in cell culture without discernible changes. The cells revealed the typical gene expression pattern of MKTPCs and HTPCs. Like HTPCs, iMKTPCs express purinergic receptors and ATP exposure resulted in a comparable increase of pro-inflammatory cytokines. They are therefore a promising tool for future in-depth studies concerning purinergic signalling and a translational model for human peritubular cells. The results indicated that different parts of the testicular purinergic system are involved in the regulation of various testicular functions. One is coordinating contraction of peritubular cells in the context of sperm transport, another one is involved in the regulation of inflammatory events. If transferable to the in vivo situation, pharmacological interference with receptors and ectonucleotidases of this system might represent new approaches in the treatment of male infertility.

Abstract

Die Reaktion von extrazellulärem ATP und zugehörigen Metaboliten ist Teil der purinergen Signalmechanismen und wird über membranständige Rezeptoren vermittelt. Dieses Signalweg-System ist im Hoden noch immer unzureichend untersucht, es gibt aber zunehmend Anzeichen dafür, dass es in die parakrine Kommunikation von Zellen involviert ist. Die Spermatogenese findet in den Hodenkanälchen statt, welche von glattmuskelzellähnlichen peritubulären Zellen umgeben sind. Bisher ist es aber noch weitestgehend unbekannt, wie Spermien durch das Lumen der Hodenkanälchen transportiert werden. Die vorliegende Studie beschreibt Hinweise auf eine Beteiligung von extrazellulärem ATP, vermittelt durch P2-Rezeptor Signalwege, als physiologischer Auslöser von kontraktilen Kräften in peritubulären Zellen, und einem daraus resultierenden Spermientransport. Adenosin ist der finale Metabolit von ATP, wirkt über Adenosin-Rezeptoren, und es wurde festgestellt, dass es als ein pro-inflammatorisches Molekül im humanen Hoden agiert. In humanen testikulären peritubulären Zellen (HTPC) sind sowohl die Adenosin-Rezeptoren als auch die Ektonukleotidasen CD39 und CD73, welche Adenosin generieren, in situ und in vitro vorhanden. Anhand des Malachite Green Assays, welcher freie Phosphate nachweist, wurde gezeigt, dass beide Ektonukleotidasen dazu fähig sind, extrazelluläres ATP zu ATP-Metaboliten zu dephosphorylieren. Eine pharmakologische Blockierung von CD39 reduzierte nicht nur die Entstehung von extrazellulärem Phosphat, es verringerte auch proinflammatorische Zytokinlevel, welche nach ATP-Stimulation erhöht waren. Tatsächlich erhöhten sich auch durch Adenosin und analoge Moleküle proinflammatorische Zytokinlevel. Weitere Untersuchungen, wie eine Herunterregulierung mithilfe von siRNA, identifizierten den Rezeptor A2B als hauptverantwortlichen Mediator für Adenosin-abhängige pro-inflammatorische Zytokinproduktion in peritubulären Zellen. HTPCs sind primäre Zellen und in vitro in ihrem Nutzen aufgrund von Verfügbarkeit, Heterogenität und replikativer Seneszenz eingeschränkt. Daher wurden peritubuläre Zellen des Weißbüschelaffen Callithrix jacchus (MKTPC) mit Hilfe des PiggyBac Transposons und einem darin enthaltenen Gen der humanen Telomerase (hTERT), immortalisiert. Diese erzeugten iMKTPCs behielten ihren Phänotypen nach Immortalisierung bei und konnten in der Zellkultur kontinuierlich und ohne erkennbare Veränderungen kultiviert werden. Die Zellen zeigten typische Expressionsmuster wie sie von MKTPCs und HTPCs bekannt sind. Verglichen mit HTPCs exprimieren iMKTPCs purinerge Rezeptoren, und Stimulation mit ATP erzeugte vergleichbare Erhöhungen von pro-inflammatorischen Zytokinleveln. Siestellen daher ein vielversprechendes Mittel für tiefgreifendere Studien am purinergen System dar und sind ein translationales Modell für humane peritubuläre Zellen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeiten zeigen, dass unterschiedliche Teile des purinergen Systems im Hoden an verschiedenen Regulationsmechanismen der Hodenfunktion beteiligt sind. Ein Teil koordiniert Kontraktionsmechanismen von peritubulären Zellen im Rahmen des Spermientransports, ein anderer ist involviert in die Regulation von inflammatorischen Vorgängen. Sofern dies auf die in vivo Situation übertragbar ist, könnte eine pharmakologische Beeinflussung von Rezeptoren und Ektonukleotidasen dieses Systems neue Herangehensweisen bei der Behandlung von männlicher Unfruchtbarkeit repräsentieren.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
• Fakultäten: Fakultät für Biologie
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 25. April 2022
• 1. Bericht­erstatter:in: Kunz, Lars