Single-round rhabdovirus replicons and an augmented RBD: A safe and effective combination for a SARS-CoV-2 vaccine

Dorman, Alexandru Adrian (2022): Single-round rhabdovirus replicons and an augmented RBD: A safe and effective combination for a SARS-CoV-2 vaccine. Dissertation, LMU München: Fakultät für Chemie und Pharmazie

Abstract

The ongoing SARS-CoV-2 pandemic can only be curbed by a concerted, global vaccination effort. Vaccines are used in healthy populations and represent a voluntary, preventative intervention while requiring application in most of the populace to induce herd immunity. Therefore, vaccines must meet the highest possible safety standards and at the same time induce a beneficial immune reaction and protection against the pathogen in question. To address these functionally opposite goals, we designed, created, and tested a vaccine platform based on non spreading, single round rhabdovirus vectors expressing a highly immunogenic antigen construct consisting of a cell surface anchored SARS CoV 2 receptor binding domain (RBD) that, in addition to being presented on the cell surface of transduced cells, is incorporated into budding rhabdovirus virions and non infectious pseudovirus particles. The RBD sequence was derived from the ancestral SARS CoV 2 Wuhan strain and genetically fused to the RABV G stem, transmembrane domain, and intracellular tail. This so termed “minispike” was characterized in detail, revealing efficient expression, post translational modification, and insertion into cell membrane and viral particles. Correct folding and adoption of a biologically relevant conformation was demonstrated by specific recognition of the construct by COVID 19 patient sera and SARS CoV 2 S binding mAbs on both live and fixed cells. A series of G deleted, single round vectors containing one to three copies of the minispike cistron was cloned, rescued and characterized in regard to minispike expression levels and viral titers. We then chose VSV∆G minispike eGFP (monovalent, non-spreading) to immunize BALB/c mice. Sera from these mice was tested for the capacity to neutralize SARS CoV 2 S mediated infection in authentic and surrogate virus neutralization assays. Considerable neutralization titers comparable to convalescents from severe COVID 19 were induced already after prime vaccination and further improved by boost vaccination. The minispike immune sera were further tested for their neutralization capacity against prevalent SARS CoV 2 variants of concern (including alpha, beta, gamma and delta), displaying a remarkable resistance to escape. The delta variant showed the most severe reduction in neutralizing titers (8 to 12 fold). In contrast, the beta variant, which is described to have the most pronounced immune escape phenotype for both convalescents and vaccinees, was readily neutralized with only a two fold reduction in neutralizing titers. These findings indicate the induction of a diverse and robust neutralizing antibody response targeting multiple distinct epitopes on the S RBD by minispike immunization. Finally, live virus challenge experiments in susceptible K18-hACE mice with ancestral SARS CoV 2 as well as the delta variant revealed that a single vaccination with VSV∆G minispike eGFP is sufficient to completely protect the mice from all clinical signs of SARS CoV 2 induced disease. Remarkably, even though we saw the highest decline in neutralizing titers against delta, mice were still equally well protected against this variant.

Abstract

Die anhaltende SARS-CoV-2-Pandemie kann nur durch konzertierte, weltweite Impfaktionen eingedämmt werden. Impfstoffe gegen pandemische Erreger stellen eine freiwillige, vorbeugende Prävention am Gesunden dar und erfordern Anwendung bei dem Großteil der Bevölkerung, um eine effektive Herdenimmunität herbeizuführen zu können. Daher müssen Impfstoffe höchstmögliche Sicherheitsstandards erfüllen und gleichzeitig eine effektive, spezifische Immunreaktion und einen verlässlichen Schutz gegen den jeweiligen Erreger auslösen. Um diese funktionell gegensätzlichen Ziele zu erreichen, haben wir eine Impfstoffplattform entwickelt und getestet, die auf sich nicht ausbreitenden, sog. „single-round“ Rhabdovirus-Vektoren basiert, welche ein hoch immunogenes Antigenkonstrukt exprimieren. Dieses besteht aus der zelloberflächenverankerten Rezeptorbindungsdomäne (RBD) des SARS-CoV-2 Spike (S) Proteins, die sowohl auf der Zellmembran transduzierter Zellen als auch in Rhabdovirus-Virionen und nicht-infektiösen Pseudovirus-Partikel eingebaut und präsentiert wird. Die RBD-Sequenz wurde vom ursprünglichen SARS-CoV-2-Wuhan-Stamm abgeleitet und genetisch mit dem extrazellulären Stamm, der Transmembran- und Intrazellulärdomäne des Tollwutvirus-Glykoproteins (G) fusioniert. Dieses sogenannte „Minispike“ wurde im Detail charakterisiert, wobei effiziente Expression, posttranslationale Modifikation und Insertion in Zellmembranen und Viruspartikel gezeigt werden konnten. Die korrekte Faltung in eine biologisch relevante Konformation wurde durch die spezifische Erkennung des Konstrukts durch COVID-19-Patientenseren und SARS-CoV 2 S-bindende monoklonale Antikörper sowohl in Lebendzell-Mikroskopie als auch auf fixierten Zellen bestätigt. Eine Reihe nicht ausbreitungsfähiger, „single-round“ rekombinanter Viren, bei denen das Gen für das virale Glykoprotein gegen eine bis drei Kopien des Minispike-Gens ausgetauscht war, wurden im Hinblick auf Expressionslevel des Minispike-Proteins und Attenuierung charakterisiert. Anschließend wurden BALB/c-Mäuse mit einem Konstrukt immunisiert, welches auf dem G-deletierten Vektorvirus VSV basiert und eine Kopie des Minispike-Gens (VSV∆G minispike eGFP) aufweist. Immunseren von diesen Mäusen wurden auf ihre Fähigkeit getestet, eine SARS-CoV 2 S-vermittelte Infektion zu neutralisieren, wobei sowohl S-pseudotypsierte Pseudoviren als auch authentisches SARS-CoV-2 zum Einsatz kamen. Eine erhebliche Neutralisationsaktivität, vergleichbar mit denen schwerkranker COVID-19 Patienten, wurde bereits nach der Grundimpfung induziert und durch eine Auffrischimpfung weiter erhöht. Diese Minispike-Immunseren wurden weiter auf ihre Neutralisationskapazität gegen besorgniserregende vorherrschende SARS-CoV-2-Varianten (einschließlich Alpha, Beta, Gamma und Delta) getestet und zeigten eine bemerkenswerte Resistenz gegen Immunevasion. Die Delta-Variante wies dabei mit einer 8- bis 12-fachen Reduktion der Neutralisationstiter den höchsten Immun-Escape auf. Im Gegensatz dazu wurde die Beta-Variante, für die sowohl bei Genesenen als auch bei Geimpften der ausgeprägteste Immun-Escape-Phänotyp beschrieben wurde, hocheffektiv (mit einer Reduktion um 50%) neutralisiert. Diese Ergebnisse sprechen für die Induktion einer breiten und robusten neutralisierenden Antikörperantwort nach VSV∆G Minispike-Immunisierung, die auf mehrere, unabhängige Epitope der S RBD abzielt. Diese Ergebnisse wurden in SARS-CoV-2 Challenge Experimenten in K18-hACE-Mäusen bestätigt. Sowohl bei Challenge mit dem ursprünglichen SARS-CoV 2 als auch mit der Delta-Variante reichte eine einzelne Impfung mit VSV∆G minispike eGFP aus, um alle Mäuse vollständig vor sämtlichen klinischen Anzeichen einer SARS CoV 2 induzierten Erkrankung zu schützen. Besonders hervorzuheben ist dabei, dass die Mäuse gegen die Delta-Variante ebenso gut geschützt waren, wie gegen das parentale Virus, obwohl die Neutralisationstiter gegen diese Variante die höchste Reduktion aufwiesen. Dies unterstreicht die Robustheit eines durch eine einzelne Impfung mit VSV∆G Minispike eGFP hervorgerufene Schutzwirkung.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: VSV, SARS-CoV-2, Corona, Vaccine, single-round, RBD, Neutralization
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
• Fakultäten: Fakultät für Chemie und Pharmazie
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 7. Februar 2022
• 1. Bericht­erstatter:in: Förstemann, Klaus