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Toward nanoscale rapid prototyping: development and characterization of DNA-based platforms for multivalent interactions and locomotion
Toward nanoscale rapid prototyping: development and characterization of DNA-based platforms for multivalent interactions and locomotion
DNA nanotechnology exploits the quaternary logic of DNA and uses its molecular programmability for the directed self-assembly into nanoscale objects. Those exhibit outstanding structural complexity and chemical addressability with a resolution down to about 6 nm. Launching a vast number of high-precision applications has demonstrated the versatility of the field. DNA origami folding is a popular technique to design and assemble DNA nanostructures using a long single DNA scaffold strand that is brought into 2D and 3D shapes by programming hundreds of short oligonucleotides to bind at locally distant regions on the scaffold based on Watson-Crick base-pairing. Programmed DNA strand displacement reactions are a useful tool to render DNA origami structures dynamic. Witnessing the great achievements of the 3D printing technology on the macroscale motivates one to explore ideas of how to transfer the concept of rapid prototyping to the nanoscale to achieve a similar impact. This thesis presents proof-of-concept data showing that the techniques of DNA selfassembly provide a demand-meeting toolbox for this challenge. The idea is approached from two sides. Implementation of rapid prototyping requires platforms for the simultaneous coordination of numerous interactions as well as reversible and repetitive mechanisms to transport material to designated locations. The first part of the thesis thus presents three new design strategies for the assembly of multi-layer DNA-origami architectures with maximized surface areas for a high number of functional sites. The approaches are implemented on square-, honeycomb-, and squareholey lattices and challenges with respect to the stability of the structures are addressed. This resulted in a considerate set of definite design recommendations as well as refined purification protocols. Structures with up to 200 individually addressable, functional sites are going to be presented. The second part of the thesis shows that these architectures can undergo polyvalent interactions and a novel mechanism to displace their surfaces with respect to each other is implemented. Data will be discussed showing the promotion of large DNA arrays along rigid DNA origami tracks based on the cyclic activation and deactivation of a set of six, orthogonal fuel strands for a controlled forward and backward motion. The mechanism was validated using gel electrophoresis and transmission electron microscopy. The small step size of 3.4 nm remains to be confirmed by deploying higher-resolution detection methods. Rapid prototyping on the nanoscale is believed to be a promising pathway toward future technologies for atomically precise manufacturing which is one of the main incentives for the presented studies., DNA Nanotechnologie nutzt die quaternäre Logik der Watson-Crick Basenpaarung von DNA und ihre damit einhergehende, molekulare Programmierbarkeit für die Selbstassemblierung von Objekten auf Nano-Ebene. Basierend auf einer Auflösung von 6 nm, zeichnen sich diese durch ihre strukturelle Komplexität und chemische Adressierbarkeit aus. Eine große Anzahl an bereits demonstrierten Hochpräzisions-Anwendungen zeigt die Vielfältigkeit des Forschungsgebietes. Die sogenannte DNA-Origami Faltung ist eine etablierte Technik des Fachgebietes, um DNA-Nanostrukturen zu designen und zu synthetisieren. Dabei wird ein langer DNA-Einzelstrang als Gerüst für die Anlagerung vieler kurzer Oligonukleotide verwendet. Die Anlagerung kann auf Grund der Watson-Crick Basenpaarung so programmiert werden, dass die kleinen DNA Fragmente an lokal entfernten Stellen entlang des Gerüststrangs binden und diesen damit in 2D- und 3D-Formen bringen. Durch gesteuerte DNA-Strangmigration, ein Prozess der in der Fachliteratur als DNA strand displacement bekannt ist, können den DNA-Origami Strukturen dynamische Eigenschaften verliehen werden. Über die letzten Jahrzehnte demonstrierten verschiedene Formen des 3D-Drucks den revoluzionären Charakter einer solchen Technologie und deren gewinnbringenden Anwendungen für Forschung und Industrie. Dies motiviert Ideen zu entwickeln, um zum Zwecke eines ähnlich positiven Einflusses, eine Form der schnellen Prototypenentwicklung auf die Nano-Ebene zu übertragen. Die vorliegende Arbeit präsentiert Machbarkeitsnachweise, die zeigen, dass sich die Techniken der DNA-Selbstassemblierung, wie die DNA-Origami Technik, für diese Herausforderung besonders gut eignen. Sich am Beipiel des 3D-Drucks orientierend, wird sich dieser Idee aus zwei Richtungen angenähert. Es bedarf erstens Plattformen, die die Koordination einer Vielzahl von Interaktionen zur selben Zeit erlauben und zweitens reversible und repetierende Transport-Mechanismen, die die benötigten molekularen Bausteine an die gewünschten Zielorte bringen. Dies zum Ziel, präsentiert der erste Teil dieser Arbeit die Entwicklung und Validierung dreier, neuer Design-Strategien zur Oberflächenmaximierung von DNA-Origami Strukturen, um deren Kapazitäten für Funktionalisierungen und Wechselwirkungen zu steigern. Die neuen Ansätze wurden dabei auf sogenannten quadratischen (square-), hexagonalen (honeycomb-) und quadratisch-löchrigen (square-holey-) DNA-Gittern implementiert. Herausforderungen bezüglich der Stabilität der generierten Strukturen werden diskutiert und Lösungen präsentiert. Eine Reihe von definitiven Design-Empfehlungen als auch verfeinerte Aufreinigungsprotokolle für die Erstellung von Strukturen mit bis zu 200 individuell adressierbaren, funktionalen Anlagerungstellen wurden in diesem Zusammenhang entwickelt. Im zweiten Teil der Arbeit wird gezeigt, dass die entwickelten DNA-Strukturen polyvalent miteinander wechselwirken und gesteuert werden können. Dies wird erreicht durch einen neuartigen Mechanismus, der im Zuge dieser Arbeit entwickelt wurde. Eine zyklische Aktivierung und Deaktivierung eines Sets bestehend aus sechs orthogonalen DNAEinzelsträngen wird benutzt, um eine kontrollierte Vorwärts- und Rückwärtsbewegung der großen DNA-basierten Plattformen auf festen DNA-Origami Straßen zu induzieren. Der Mechanismus wurde mittels Gelelektrophorese und Transmissionselektronenmikroskopie validiert. Die Validierung der implementierten, kleinen Schrittgröße von 3.4 nm steht dabei noch aus und wird durch die Anwendung höher-auflösender Detektionsmethoden angestrebt. Eine Rapid-Prototyping-Technologie auf Nano-Ebene wird als vielversprechender Ansatz zur Entwicklung zukünftiger, atomisch-präziser Herstellungsprozesse für die Industrie angesehen und ist einer der Hauptmotivatoren der vorliegenden Arbeit.
DNA nanostructures, DNA origami, platforms, multi-site interactions, DNA motor, DNA stepper, self-assembly, rapid prototyping, 3D printer, cyclic stepping, strand displacement
Kilwing, Luzia
2021
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Kilwing, Luzia (2021): Toward nanoscale rapid prototyping: development and characterization of DNA-based platforms for multivalent interactions and locomotion. Dissertation, LMU München: Faculty of Physics
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Abstract

DNA nanotechnology exploits the quaternary logic of DNA and uses its molecular programmability for the directed self-assembly into nanoscale objects. Those exhibit outstanding structural complexity and chemical addressability with a resolution down to about 6 nm. Launching a vast number of high-precision applications has demonstrated the versatility of the field. DNA origami folding is a popular technique to design and assemble DNA nanostructures using a long single DNA scaffold strand that is brought into 2D and 3D shapes by programming hundreds of short oligonucleotides to bind at locally distant regions on the scaffold based on Watson-Crick base-pairing. Programmed DNA strand displacement reactions are a useful tool to render DNA origami structures dynamic. Witnessing the great achievements of the 3D printing technology on the macroscale motivates one to explore ideas of how to transfer the concept of rapid prototyping to the nanoscale to achieve a similar impact. This thesis presents proof-of-concept data showing that the techniques of DNA selfassembly provide a demand-meeting toolbox for this challenge. The idea is approached from two sides. Implementation of rapid prototyping requires platforms for the simultaneous coordination of numerous interactions as well as reversible and repetitive mechanisms to transport material to designated locations. The first part of the thesis thus presents three new design strategies for the assembly of multi-layer DNA-origami architectures with maximized surface areas for a high number of functional sites. The approaches are implemented on square-, honeycomb-, and squareholey lattices and challenges with respect to the stability of the structures are addressed. This resulted in a considerate set of definite design recommendations as well as refined purification protocols. Structures with up to 200 individually addressable, functional sites are going to be presented. The second part of the thesis shows that these architectures can undergo polyvalent interactions and a novel mechanism to displace their surfaces with respect to each other is implemented. Data will be discussed showing the promotion of large DNA arrays along rigid DNA origami tracks based on the cyclic activation and deactivation of a set of six, orthogonal fuel strands for a controlled forward and backward motion. The mechanism was validated using gel electrophoresis and transmission electron microscopy. The small step size of 3.4 nm remains to be confirmed by deploying higher-resolution detection methods. Rapid prototyping on the nanoscale is believed to be a promising pathway toward future technologies for atomically precise manufacturing which is one of the main incentives for the presented studies.

Abstract

DNA Nanotechnologie nutzt die quaternäre Logik der Watson-Crick Basenpaarung von DNA und ihre damit einhergehende, molekulare Programmierbarkeit für die Selbstassemblierung von Objekten auf Nano-Ebene. Basierend auf einer Auflösung von 6 nm, zeichnen sich diese durch ihre strukturelle Komplexität und chemische Adressierbarkeit aus. Eine große Anzahl an bereits demonstrierten Hochpräzisions-Anwendungen zeigt die Vielfältigkeit des Forschungsgebietes. Die sogenannte DNA-Origami Faltung ist eine etablierte Technik des Fachgebietes, um DNA-Nanostrukturen zu designen und zu synthetisieren. Dabei wird ein langer DNA-Einzelstrang als Gerüst für die Anlagerung vieler kurzer Oligonukleotide verwendet. Die Anlagerung kann auf Grund der Watson-Crick Basenpaarung so programmiert werden, dass die kleinen DNA Fragmente an lokal entfernten Stellen entlang des Gerüststrangs binden und diesen damit in 2D- und 3D-Formen bringen. Durch gesteuerte DNA-Strangmigration, ein Prozess der in der Fachliteratur als DNA strand displacement bekannt ist, können den DNA-Origami Strukturen dynamische Eigenschaften verliehen werden. Über die letzten Jahrzehnte demonstrierten verschiedene Formen des 3D-Drucks den revoluzionären Charakter einer solchen Technologie und deren gewinnbringenden Anwendungen für Forschung und Industrie. Dies motiviert Ideen zu entwickeln, um zum Zwecke eines ähnlich positiven Einflusses, eine Form der schnellen Prototypenentwicklung auf die Nano-Ebene zu übertragen. Die vorliegende Arbeit präsentiert Machbarkeitsnachweise, die zeigen, dass sich die Techniken der DNA-Selbstassemblierung, wie die DNA-Origami Technik, für diese Herausforderung besonders gut eignen. Sich am Beipiel des 3D-Drucks orientierend, wird sich dieser Idee aus zwei Richtungen angenähert. Es bedarf erstens Plattformen, die die Koordination einer Vielzahl von Interaktionen zur selben Zeit erlauben und zweitens reversible und repetierende Transport-Mechanismen, die die benötigten molekularen Bausteine an die gewünschten Zielorte bringen. Dies zum Ziel, präsentiert der erste Teil dieser Arbeit die Entwicklung und Validierung dreier, neuer Design-Strategien zur Oberflächenmaximierung von DNA-Origami Strukturen, um deren Kapazitäten für Funktionalisierungen und Wechselwirkungen zu steigern. Die neuen Ansätze wurden dabei auf sogenannten quadratischen (square-), hexagonalen (honeycomb-) und quadratisch-löchrigen (square-holey-) DNA-Gittern implementiert. Herausforderungen bezüglich der Stabilität der generierten Strukturen werden diskutiert und Lösungen präsentiert. Eine Reihe von definitiven Design-Empfehlungen als auch verfeinerte Aufreinigungsprotokolle für die Erstellung von Strukturen mit bis zu 200 individuell adressierbaren, funktionalen Anlagerungstellen wurden in diesem Zusammenhang entwickelt. Im zweiten Teil der Arbeit wird gezeigt, dass die entwickelten DNA-Strukturen polyvalent miteinander wechselwirken und gesteuert werden können. Dies wird erreicht durch einen neuartigen Mechanismus, der im Zuge dieser Arbeit entwickelt wurde. Eine zyklische Aktivierung und Deaktivierung eines Sets bestehend aus sechs orthogonalen DNAEinzelsträngen wird benutzt, um eine kontrollierte Vorwärts- und Rückwärtsbewegung der großen DNA-basierten Plattformen auf festen DNA-Origami Straßen zu induzieren. Der Mechanismus wurde mittels Gelelektrophorese und Transmissionselektronenmikroskopie validiert. Die Validierung der implementierten, kleinen Schrittgröße von 3.4 nm steht dabei noch aus und wird durch die Anwendung höher-auflösender Detektionsmethoden angestrebt. Eine Rapid-Prototyping-Technologie auf Nano-Ebene wird als vielversprechender Ansatz zur Entwicklung zukünftiger, atomisch-präziser Herstellungsprozesse für die Industrie angesehen und ist einer der Hauptmotivatoren der vorliegenden Arbeit.