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Advancing quantitative DNA-mediated single-molecule fluorescence microscopy
Advancing quantitative DNA-mediated single-molecule fluorescence microscopy
Fluorescence microscopy has become a standard tool within the life sciences but its major drawback has been its maximum achievable resolution (≈ 250 nm) given by the diffraction limit. The advent of super-resolution (SR) microscopy could overcome this limitation by bringing fluorescence microscopy into the nanoscale, reaching resolutions on the molecular level. The SR methods summarized as Single-Molecule Localization Microscopy (SMLM) circumvent the diffraction limit by acquiring image sequences of stochastically activated subsets of ‘blinking’ target structures. The subsequent fitting of the recorded fluorescent bursts from individual emitters allows localization of individual fluorophore positions. This concept is similarly applied in Single Particle Tracking (SPT) to monitor the motion of individual biomolecules with nanometer precision. However, a quantitative interpretation of both SMLM and SPT data is often not straightforward since it requires exact modeling of the photo-physics of the used fluorescent labels. The SMLM variant DNA-PAINT (Points Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography) achieves the necessary blinking based on the concept of transient DNA hybridization. Hence, DNA-PAINT can in principle be largely decoupled of the photo-physical properties of the fluorophores in use offering a unique potential for quantitative interpretation. In this work, we found that DNA-PAINT still suffers from a photo-induced permanent loss of docking strands and can be prone to remaining photo-physical artifacts caused by inhomogeneous optical excitation. While the first obstacle could be largely reduced by lowering excitation intensities, the latter obstacle could be overcome through the construction of a fluorescence microscope featuring a flat-top illumination profile. Taken together with advancements in the ‘speed-up’ of the binding reaction, this led to the development of a molecular counting approach able to extract absolute docking strand copy numbers and local hybridization rates of individual DNA-PAINT localization clusters within a single DNA-PAINT image. Finally, the concept of DNA-PAINT was repurposed to generate a live-cell compatible, 1:1 labeling approach for SPT offering observation times in the range of tens of minutes, paving the way for an in-depth quantitative analysis of the underlying motion dynamics. In summary, this thesis extends the possibilities for a robust quantitative interpretation of fluorescence microscopy data at the single-molecule level, by exploiting the concept of DNA-mediated fluorophore exchange., Die Fluoreszenzmikroskopie ist zu einer der zentralen Untersuchungsmethoden der heutigen Lebenswissenschaften geworden. Den größten Nachteil dieser Methode stellte bisher deren maximal erreichbare räumliche Auflösung dar (≈ 250 nm), die durch die Entwicklung der super-auflösenden (SR) Fluoreszenzmikroskopie und dem dadurch erreichbaren Auflösungsvermögen bis auf die molekulare Ebene überwunden werden konnte. Eine Unterkategorie in der SR-Fluoreszenzmikroskopie stellt die Familie der Einzelmolekül Lokalisierungsmikroskopie (SMLM) dar. Diese erreicht Nanometer-Präzision indem lediglich Subpopulationen der Ziel-Moleküle in der Probe stochastisch angeregt werden, sodass ein statistisches Fit(ting) der “blinkenden” Einzelmolekül-Signale deren Lokalisierung erlaubt. Außerhalb der SMLM wird das Konzept der Lokalisierung auch zum Verfolgen nanoskopischer Bewegungen von Einzelmolekülen genutzt (SPT). Eine quantitative Auswertung von SMLM als auch SPT Experimenten wird dadurch erschwert, dass diese exakte und belastbare Modelle der zugrundeliegenden Einzelmolekül-Photophysik erfordert. Ein SMLM-Verfahren namens DNA-PAINT (Points Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography) erreicht das notwendige SMLM-Blinken hingegen, indem es die transiente DNA-Hybridisierung nutzt. DNA-PAINT kann daher weitgehend von der Photophysik der verwendeten Fluorophore entkoppelt werden und bietet somit ein einzigartiges Potential für eine quantitative Interpretation der erhaltenen Daten. In dieser Arbeit konnte herausgearbeitet werden, dass sowohl der photo-induzierte Verlust von Bindesträngen, als auch eine inhomogene Ausleuchtung der Probe, zu Artefakten in der Auswertung von DNA-PAINT Bildrekonstruktionen führen können. Sowohl durch eine Verringerung der verwendeten Anregungs-Intensitäten, als auch durch den Aufbau eines Mikroskops mit “flat-top” Ausleuchtung, konnten hierbei beide Effekte auf ein Minimum reduziert werden. Die Erhöhung der Assoziationsraten der DNA-PAINT Bindungsreaktion erlaubte es schließlich eine Methode zu entwickeln, mit der sowohl die Anzahl der enthaltenen Bindestränge, als auch die lokalen Hybridisierungsraten, in einzelnen Lokalisations-Anhäufungen einer DNA-PAINT Bildrekonstruktion ermittelt werden konnten. Schließlich konnte die DNA-PAINT Bindungsreaktion dazu verwendet werden, um eine 1:1 Molekülmarkierung zu entwickeln, die eine Beobachtung des Fluoreszenzsignals von diffundierenden Einzelmolekülen über mehrere Minuten zuließ. Dies konnte dazu verwendet werden die zugrundeliegenden Diffusionseigenschaften mit hoher Genauigkeit quantitativ zu beschreiben. Zusammenfassend erweitert diese Arbeit die Möglichkeiten einer zuverlässigen, quantitativen Auswertung von Fluoreszenzmikroskopie-Daten auf der Ebene einzelner Moleküle, indem sie das Prinzip eines konstanten Austauschs von Fluorophoren mittels der reversiblen DNA-Hybridisierung nutzt.
fluorescence microscopy, single-molecule localization microscopy, DNA-PAINT, single particle tracking, molecular counting
Stehr, Florian
2021
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Stehr, Florian (2021): Advancing quantitative DNA-mediated single-molecule fluorescence microscopy. Dissertation, LMU München: Faculty of Physics
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Abstract

Fluorescence microscopy has become a standard tool within the life sciences but its major drawback has been its maximum achievable resolution (≈ 250 nm) given by the diffraction limit. The advent of super-resolution (SR) microscopy could overcome this limitation by bringing fluorescence microscopy into the nanoscale, reaching resolutions on the molecular level. The SR methods summarized as Single-Molecule Localization Microscopy (SMLM) circumvent the diffraction limit by acquiring image sequences of stochastically activated subsets of ‘blinking’ target structures. The subsequent fitting of the recorded fluorescent bursts from individual emitters allows localization of individual fluorophore positions. This concept is similarly applied in Single Particle Tracking (SPT) to monitor the motion of individual biomolecules with nanometer precision. However, a quantitative interpretation of both SMLM and SPT data is often not straightforward since it requires exact modeling of the photo-physics of the used fluorescent labels. The SMLM variant DNA-PAINT (Points Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography) achieves the necessary blinking based on the concept of transient DNA hybridization. Hence, DNA-PAINT can in principle be largely decoupled of the photo-physical properties of the fluorophores in use offering a unique potential for quantitative interpretation. In this work, we found that DNA-PAINT still suffers from a photo-induced permanent loss of docking strands and can be prone to remaining photo-physical artifacts caused by inhomogeneous optical excitation. While the first obstacle could be largely reduced by lowering excitation intensities, the latter obstacle could be overcome through the construction of a fluorescence microscope featuring a flat-top illumination profile. Taken together with advancements in the ‘speed-up’ of the binding reaction, this led to the development of a molecular counting approach able to extract absolute docking strand copy numbers and local hybridization rates of individual DNA-PAINT localization clusters within a single DNA-PAINT image. Finally, the concept of DNA-PAINT was repurposed to generate a live-cell compatible, 1:1 labeling approach for SPT offering observation times in the range of tens of minutes, paving the way for an in-depth quantitative analysis of the underlying motion dynamics. In summary, this thesis extends the possibilities for a robust quantitative interpretation of fluorescence microscopy data at the single-molecule level, by exploiting the concept of DNA-mediated fluorophore exchange.

Abstract

Die Fluoreszenzmikroskopie ist zu einer der zentralen Untersuchungsmethoden der heutigen Lebenswissenschaften geworden. Den größten Nachteil dieser Methode stellte bisher deren maximal erreichbare räumliche Auflösung dar (≈ 250 nm), die durch die Entwicklung der super-auflösenden (SR) Fluoreszenzmikroskopie und dem dadurch erreichbaren Auflösungsvermögen bis auf die molekulare Ebene überwunden werden konnte. Eine Unterkategorie in der SR-Fluoreszenzmikroskopie stellt die Familie der Einzelmolekül Lokalisierungsmikroskopie (SMLM) dar. Diese erreicht Nanometer-Präzision indem lediglich Subpopulationen der Ziel-Moleküle in der Probe stochastisch angeregt werden, sodass ein statistisches Fit(ting) der “blinkenden” Einzelmolekül-Signale deren Lokalisierung erlaubt. Außerhalb der SMLM wird das Konzept der Lokalisierung auch zum Verfolgen nanoskopischer Bewegungen von Einzelmolekülen genutzt (SPT). Eine quantitative Auswertung von SMLM als auch SPT Experimenten wird dadurch erschwert, dass diese exakte und belastbare Modelle der zugrundeliegenden Einzelmolekül-Photophysik erfordert. Ein SMLM-Verfahren namens DNA-PAINT (Points Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography) erreicht das notwendige SMLM-Blinken hingegen, indem es die transiente DNA-Hybridisierung nutzt. DNA-PAINT kann daher weitgehend von der Photophysik der verwendeten Fluorophore entkoppelt werden und bietet somit ein einzigartiges Potential für eine quantitative Interpretation der erhaltenen Daten. In dieser Arbeit konnte herausgearbeitet werden, dass sowohl der photo-induzierte Verlust von Bindesträngen, als auch eine inhomogene Ausleuchtung der Probe, zu Artefakten in der Auswertung von DNA-PAINT Bildrekonstruktionen führen können. Sowohl durch eine Verringerung der verwendeten Anregungs-Intensitäten, als auch durch den Aufbau eines Mikroskops mit “flat-top” Ausleuchtung, konnten hierbei beide Effekte auf ein Minimum reduziert werden. Die Erhöhung der Assoziationsraten der DNA-PAINT Bindungsreaktion erlaubte es schließlich eine Methode zu entwickeln, mit der sowohl die Anzahl der enthaltenen Bindestränge, als auch die lokalen Hybridisierungsraten, in einzelnen Lokalisations-Anhäufungen einer DNA-PAINT Bildrekonstruktion ermittelt werden konnten. Schließlich konnte die DNA-PAINT Bindungsreaktion dazu verwendet werden, um eine 1:1 Molekülmarkierung zu entwickeln, die eine Beobachtung des Fluoreszenzsignals von diffundierenden Einzelmolekülen über mehrere Minuten zuließ. Dies konnte dazu verwendet werden die zugrundeliegenden Diffusionseigenschaften mit hoher Genauigkeit quantitativ zu beschreiben. Zusammenfassend erweitert diese Arbeit die Möglichkeiten einer zuverlässigen, quantitativen Auswertung von Fluoreszenzmikroskopie-Daten auf der Ebene einzelner Moleküle, indem sie das Prinzip eines konstanten Austauschs von Fluorophoren mittels der reversiblen DNA-Hybridisierung nutzt.