Massenspektrometrische Methoden zur Untersuchung enzymatisch modifizierter RNA

Hagelskamp, Felix (2021): Massenspektrometrische Methoden zur Untersuchung enzymatisch modifizierter RNA. Dissertation, LMU München: Fakultät für Chemie und Pharmazie

Abstract

Die Dynamik von RNA-Modifikationen ist im Bereich der Epitranskriptom-Forschung von zentraler Bedeutung. Die Wichtigkeit von RNA-modifizierenden Enzymen, welche die RNA-Modifikationsdichte beeinflussen, wird insbesondere deutlich, wenn man die Verbindung zu neurologischen Erkrankungen, geistiger Einschränkung und vielen Krebsarten kennt. Eine Aminosäuremutation im ADAT2/3-Enzymkomplex sorgt für eine Verringerung des Inosingehalts mancher tRNA-Moleküle und ist molekulare Grundlage für die Ausbildung einer schweren geistigen Beeinträchtigung in betroffenen Patienten. Ein weiteres Enzym NSUN2 methyliert mehrere Cytidine in der variablen Schleife einiger tRNA-Molekülen und seine durch einen Splicingfehler hervorgerufene Dysfunktion ist mit dem Dubowitz-Syndrom assoziiert. Die Liste der RNA-Modifikation abhängigen Krankheiten ist lang und die molekularen Grundlagen bedürfen weiterer Erforschung. Die Massenspektrometrie bietet bei der Detektion und Quantifizierung vieler RNA-Modifikationen vielversprechende Ansätze. Um das Level einer Modifikation nicht nur statisch zu bestimmen, habe ich maßgeblich bei der Entwicklung von NAIL-MS (engl. für nucleic acid isotope labeling coupled mass spectrometry) mitgewirkt. Mit dieser zur dynamischen Protein-Analyse SILAC (engl. für stable isotope labeling of amino acids in cell culture) analogen und innovativen Methode ist es möglich, zeitlich aufgelöst RNA in alte, post-methylierte und neue Nukleoside zu unterteilen und somit die dynamische Natur von RNA-Modifikationen besser zu erfassen. Nach gelungener Einführung dieser NAIL-MS-Methode in humaner Zellkultur, habe ich NAIL-MS dazu verwendet, das detaillierte Modifikationsprofil humaner Zellen mit AlkBH1, 3, 5-Enzymdefizienz zu ermitteln. Für AlkBH5, welches m6A in mRNA oxidativ demethyliert, konnte ich zusammen mit meiner Kollegin Dr. Kayla Borland eine demethylierende Aktivität in den lebenden Zellen beobachten. Sowohl AlkBH3 als auch AlkBH1 sollen m1A und m3C in tRNA demethylieren. Allerdings konnte ich mittels NAIL-MS keine demethylierende Aktivität der beiden Enzyme in tRNA oder rRNA gegenüber den möglichen Substraten m1A, m3C, m6A und m5C in vivo feststellen. Im Gegensatz dazu, konnten in vitro einige dieser Modifikations-Demethylierungen, wie erwartet, bestätigt und weitergehend absolut quantifiziert werden. Somit ist es mir gelungen, die bestehende, auf in vitro Daten beruhende Literatur zu bestätigen. Allerdings scheinen die Enzyme keine demethylierende Aktivität in ungestressten humanen Zellen zu haben. Die Komplexität humaner Zellen wird deshalb nicht nur bei der schwierigeren Wahl der Isotopenmarkierungsstrategie deutlich, sondern auch in der unerforschten Vielfalt an molekularen Adaptionsmechanismen, die für eine Kontrolle der RNA-Modifikationsdichte wichtig sind. Die NAIL-MS-Pulse-Chase-Analytik ist neben der Beobachtung bestehender RNA-Modifikationen hilfreich bei der Zuordnung in co- oder post-transkriptionelle Modifikationsprozesse. Bisherige Ergebnisse der Arbeitsgruppe deuteten darauf hin, dass viele Modifikationen in rRNA und tRNA, aber auch m6A in mRNA, nachträglich in die RNA eingebracht werden. Da m6A-modifiziernde Enzyme ausschließlich im Zellkern lokalisiert sind und an naszenten mRNAs arbeiten, wollte ich das Phänomen der post-transkriptionellen Modifikation genauer untersuchen. Durch die Verwendung des RNA-Transkriptionsinhibitors Actinomycin D (Acm D) konnte die Analyse der enzymatischen Post-Methylierung von Transkriptionsprozessen abgegrenzt werden. Der Gehalt an post-methyliertem m6A verringerte sich unter Acm D-Stress, was auf einen zeitlich limitierten Transkriptionsmechanismus in der Zelle hindeutet, in dem Hybrid-RNA aus unmarkierten und isotopenmarkierten Bausteinen aufgebaut wird. Meine Ergebnisse deuten darauf hin, dass NAIL-MS-Experimente eine zeitliche Limitation aufweisen, welche bei Experimentdesign bedacht werden müssen. Proteom- und Oligonukleotid-MS-Experimente werden hierzu weitere Erkenntnisse liefern. Die herkömmliche Oligonukleotid-MS-Analytik, die aufgrund der Benutzung von Ionenpaarreagenzien von nur wenigen Arbeitskreisen und auf speziell für diesen Zweck angeschafften Massenspektrometern durchgeführt wird, kann nicht kompatibel mit der Nukleosid-MS-Analytik verknüpft werden. Um diese Hürde zu beseitigen, habe ich eine Oligonukleotid-LC-Methode etabliert, mit deren Hilfe sich ionenpaarreagenzfrei, MS-schonend und kontaminationsarm, RNAs sequenzspezifisch analysieren lassen. Modifikationen in enzymatisch-modifizierter in vitro transkribierter (IVT) tRNA können somit chromatographisch von unmodifizierter getrennt, sequenziell nachgewiesen und quantifiziert werden. Die Deaminierung von Adenosin zu Inosin in der Anticodonschleife der IVT tRNAValAAC konnte ich quantitativ und positionsgenau bestimmen. Die Methode basiert auf einem spezifischen RNase T1-Verdau, mit dem auch RNA-Modifikationen in nativer totaler tRNA kartiert werden können. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sowohl mit der NAIL-MS als auch mit der Oligonukleotid-MS-Analytik das Wissen über RNA-Modifikationen, ihre Mechanismen und ihre Dynamik vergrößert wird und es für klinische Zwecke in der Behandlung von Krankheiten und zur Qualitätskontrolle einer wachsenden Zahl an RNA-basierten Medikamenten und Vakzinen genutzt werden kann.

Abstract

The dynamics of RNA modifications are important to the field of epitranscriptome research. The importance of RNA-modifying enzymes influencing RNA modification density becomes particularly clear when the link to neurological diseases, mental retardation and many cancer diseases is known. An amino acid mutation in the ADAT2/3 enzyme complex causes a reduction in the inosine content of some tRNA molecules and serves as molecular basis for the development of severe mental retardation in affected patients. Another enzyme called NSUN2 methylates several cytidines in the variable loop of some tRNA molecules and its dysfunction caused by a splicing defect is associated with the Dubowitz syndrome. The list of RNA modification-dependent diseases is long and the molecular basis requires further investigation. Mass spectrometry offers promising approaches in the detection and quantification of many RNA modifications. In order to determine the level of a modification not only statically, I played a major role in the development of NAIL-MS (nucleic acid isotope labeling coupled mass spectrometry). With this innovative method, which is analogous to the dynamic protein analysis SILAC (stable isotope labeling of amino acids in cell culture), it is possible to subdivide RNA into old, post-methylated and new nucleosides in a temporally resolved manner and thus better capture the dynamic nature of RNA modifications. After successfully introducing this NAIL-MS method in human cell culture, I used NAIL-MS to determine the detailed modification profile of human cells with AlkBH1, 3, 5 enzyme deficiency. For AlkBH5, which oxidatively demethylates m6A in mRNA, I was able to observe demethylation activity in the living cells together with my colleague Dr. Kayla Borland. Both AlkBH3 and AlkBH1 are reported to demethylate m1A and m3C in tRNA. However, using NAIL-MS, I could not detect any demethylation activity of both enzymes in tRNA or rRNA towards the possible substrates m1A, m3C, m6A and m5C in vivo. In contrast, some of these modification demethylations could be confirmed and further absolutely quantified in vitro, as expected. Thus, I have been able to confirm the existing literature based on in vitro data. However, the enzymes do not appear to have demethylating activity in unstressed human cells. The complexity of human cells is therefore not only evident in the more difficult choice of isotope labeling strategy, but also in the unexplored diversity of molecular adaptive mechanisms that are important for controlling RNA modification density. In addition to observing existing RNA modifications, NAIL-MS pulse-chase analysis is helpful in assigning them to co- or post-transcriptional modification processes. Previous results of the our group indicated that many modifications in rRNA and tRNA, but also m6A in mRNA, are subsequently introduced into the RNA. Since m6A-modifying enzymes are exclusively localized in the nucleus and work on nascent mRNAs, I wanted to investigate the phenomenon of post-transcriptional modification in more detail. By using the RNA transcription inhibitor Actinomycin D (Acm D), the analysis of enzymatic post-methylation could be distinguished from transcription processes. The level of post-methylated m6A decreased under Acm D stress, suggesting a time-limited transcription mechanism in the cell in which hybrid RNA is constructed from unlabeled and isotopically labeled building blocks. My results suggest that NAIL-MS experiments have a temporal limitation that needs to be considered in experimental planning. Proteome and oligonucleotide MS experiments will provide further insights into this. Conventional oligonucleotide MS analysis, which is carried out by only a few working groups due to the use of ion-pairing reagents and on dedicated mass spectrometers, cannot be linked compatibly with nucleoside MS analysis. To remove this hurdle, I have established an oligonucleotide LC method that can be used to analyze RNAs in a sequence-specific manner without the need for ion-pairing reagents, in a way that is gentle on MS and low in contamination. Modifications in enzymatically modified in vitro transcribed (IVT) tRNA can thus be chromatographically separated from unmodified ones, sequentially detected and quantified. I was able to quantitatively and positionally determine the deamination of adenosine to inosine in the anticodon loop of IVT tRNAValAAC. The method is based on a specific RNase T1 digestion, which can also be used to map RNA modifications in native total tRNA. In summary, both NAIL-MS and oligonucleotide MS analytics increase the knowledge of RNA modifications, their mechanisms and their dynamics and can be used for clinical purposes in the treatment of diseases and for quality control of a growing number of RNA-based drugs and vaccines.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: RNA-Modifikationen, Massenspektrometrie, Oligonukleotide, NAIL-MS, AlkBH-Enzyme
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
• Fakultäten: Fakultät für Chemie und Pharmazie
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 3. Dezember 2021
• 1. Bericht­erstatter:in: Kaiser, Stefanie