Regulation of CP12-mediated carbon metabolism by NTRC during cold acclimation

Teh, Jing Tsong (2021): Regulation of CP12-mediated carbon metabolism by NTRC during cold acclimation. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie

Abstract

In plant and algal chloroplasts redox regulation is essential for the rapid adaptation of metabolism in response to changing light conditions. NADPH-dependent thioredoxin reductase C (NTRC) is known as an alternative to the classical ferredoxin-thioredoxin system mediating these regulatory processes. By deriving reducing potential from NADPH, NTRC can function in both light and dark conditions, unlike the ferredoxin-thioredoxin system which is obligately light-dependent. Despite extensive studies of NTRC have been carried out in higher plants, not much is known in algae. In this study, the role of NTRC in the green alga Chlamydomonas reinhardtii during cold acclimation which was previously attributed to the chaperone functions of NTRC was scrutinized (Moon et al., 2015). The site-specific mutation analyses of the redox-active site of NTRC, however, revealed that the cold-sensitive phenotype displayed by ntrc loss-of-function mutants is redox-dependent instead. By means of co-immunoprecipitation and mass spectrometry, a redox- and cold-dependent binding of the Calvin Cycle Protein 12 (CP12) to NTRC was identified. The study was then extended to the vascular plant Arabidopsis thaliana and demonstrated via in vitro redox activity analyses that recombinant NTRC from C. reinhardtii reduces CP12 of both C. reinhardtii and A. thaliana and vice versa. CP12 is a scaffold protein joining two Calvin cycle enzymes, namely the phosphoribulokinase (PRK) and the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), to form an auto-inhibitory supracomplex of around 550 kDa. Therefore, the complex integrity in the ntrc knockout mutant was studied. Although NTRC deletion caused no detectable changes in the complex integrity in C. reinhardtii, dissociation of the PRK/CP12/GAPDH complex was impeded in A. thaliana. Further, in vitro treatment of C. reinhardtii lysate with NADPH-activated recombinant NTRC also demonstrated that the enzyme induces dissociation of the complex. A more direct evidence is provided by the less pronounced cold-induced elevation of GAPDH enzyme activity in C. reinhardtii ntrc knockout and cysteine-substituted mutants, in comparison to the wild type. Taken together, these results demonstrate that NTRC reduces CP12 and hence triggers the dissociation of the PRK/CP12/GAPDH complex. This is crucial under cold stress to release the enzymes for catalytic activities and regenerate NADP+ for the removal of excess electrons from the photosynthetic electron transport chain (ETC). Doing so can prevent reactive oxygen species (ROS) formation via the Mehler reaction wherein electrons from the ETC are accepted by oxygen. Next, C. reinhardtii cp12 knockout mutants were generated using CRISPR/Cas9 technique to study CP12 directly. As observed for the ntrc knockout mutant, the generated mutants also exhibited a cold-sensitive phenotype. Surprisingly, knockout of CP12 led to robust decreases in both PRK and GAPDH protein accumulations implying a protein protection effect of CP12 besides inhibiting the enzymes activities. Both functions are critical for CP12 to prepare a repertoire of enzymes which are protected from degradation and simultaneously poised to spontaneous activation in response to environmental changes. Additionally, the C. reinhardtii cp12 knockout strains also exhibited a defect in growth during the light-dark cycle. Time course PRK and GAPDH enzyme activity analyses demonstrated that cp12 knockout mutants experienced a delay in suppressing the Calvin cycle during the dark phase. However, as ntrc knockout and cysteine-substituted mutants did not display a growth defect in the light-dark cycle, a regulation of CP12 by NTRC during the diurnal rhythm is highly unlikely. Instead, redox-regulation of CP12 during the diurnal cycle can be taken over by the ferredoxin-thioredoxin In conclusion, this study discovered that contrary to previous studies, NTRC-mediated cold acclimation is redox-dependent. Further, CP12 was identified as a redox target of NTRC which was previously undiscovered. Although NTRC and CP12 have both been previously described independently to be involved in cold acclimation, the molecular mechanisms behind this have not been fully understood. This is the first report demonstrating interactions between these two proteins, and the regulation of the Calvin cycle enzymes by NTRC under cold stress, via CP12.

Abstract

In Pflanzen- und Algenchloroplasten ist die Redoxregulation essentiell für eine schnelle Anpassung des Stoffwechsels als Reaktion auf wechselnde Lichtbedingungen. Die NADPH-abhängige Thioredoxin-Reduktase C (NTRC) ist als eine Alternative zum klassischen Ferredoxin-Thioredoxin-System bekannt, durch das diese Regulationsprozesse vermittelt werden. Im Gegensatz zum Ferredoxin-Thioredoxin-System, dass obligat lichtabhängig ist, ist die NTRC durch Nutzung des Reduktionspotentials des NADPHs sowohl unter Licht- als auch unter Dunkelbedingungen funktional. Obwohl umfangreiche Studien über die NTRC in höheren Pflanzen vorliegen, ist in Algen nicht viel über dieses Enzym bekannt. In dieser Studie wurde die Rolle der NTRC in der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii während der Kälteakklimatisierung untersucht, welche zuvor auf die Chaperonfunktion der NTRC zurückgeführt wurde (Moon et al., 2015). Ortsspezifische Mutationsanalysen des aktiven Zentrumsder Thioredoxin-Domäne der NTRC zeigten jedoch, dass der kälteempfindliche Phänotyp, den ntrc loss-of-function Mutanten aufweisen, stattdessen redox-abhängig ist. Mit Hilfe von Co-Immunopräzipitation und Massenspektrometrie wurde die redox- und kälteabhängige Bindung des Calvin-Zyklus-Proteins 12 (CP12) an die NTRC nachgewiesen. Anschließend wurde die Studie auf A. thaliana ausgeweitet und mittels in vitro Redox-Aktivitätsanalyse gezeigt, dass die NTRC aus C. reinhardtii sowohl das CP12 Protein aus C. reinhardtii als auch in A. thaliana reduziert und umgekehrt. CP12 ist ein Gerüstprotein, das zwei Calvin-Zyklus-Enzyme, nämlich die Phosphoribulokinase (PRK) und die Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH), zu einem autoinhibitorischen Suprakomplex von etwa 550 kDa verbindet. Daher wurde die Integrität des Komplexes in ntrc knockout-Mutante untersucht. Obwohl der Verlust der NTRC in C. reinhardtii keine nachweisbaren Veränderungen der Komplexintegrität verursachte, war die Dissoziation des PRK/CP12/GAPDH-Komplexes in A. thaliana beeinträchtigt. Weiterhin zeigte die in vitro Behandlung von C. reinhardtii Lysat mit NADPH-aktivierter rekombinanter NTRC, dass das Enzym die Dissoziation des Komplexes induziert. Einen direkteren Beweis liefern die beobachteten Abnahmen der kälteinduzierten Erhöhungen der GAPDH-Enzymaktivitäten in C. reinhardtii ntrc-knockout und Cystein-substituierten Mutanten im Vergleich zum Wildtyp. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die NTRC CP12 reduziert und damit die Dissoziation des PRK/CP12/GAPDH-Komplexes auslöst. Dies ist unter Kältestress entscheidend, um die Enzyme für katalytische Prozesse freizusetzen und NADP+ für den Abtransport von überschüssigen Elektronen aus der photosynthetischen Elektronentransportkette (ETC) zu regenerieren. Dadurch kann die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) über die Mehler-Reaktion, bei der Elektronen aus der ETC von Sauerstoff aufgenommen werden, verhindert werden. Zur weiteren Untersuchung des CP12 Proteins aus C. reinhardtii wurden mit Hilfe der CRISPR/Cas9-Technik cp12-knockout-Mutanten erzeugt. Die generierten Mutanten zeigten ebenso wie die ntrc-knockout-Mutant einen kälteempfindlichen Phänotyp. Überraschenderweise führte die Abwesenheit von CP12 zu einer starken Abnahme der PRK- und GAPDH-Proteinakkumulation, was neben der Hemmung der Enzymaktivitäten auf einen Proteinschutz-Effekt von CP12 hindeutet. Beide Funktionen sind entscheidend dafür, dass CP12 ein Repertoire an Enzymen bereitstellt, die einerseits vor Abbau geschützt und andererseits für eine spontane Aktivierung als Reaktion auf Umweltveränderungen bereit sind. Zudem wurde bei den C. reinhardtii cp12 knockout-Stämmen ein Wachstumsdefekt im Licht-Dunkel-Zyklus festgestellt. Zeitverlaufsanalysen der PRK und GAPDH Enzymaktivitäten zeigten, dass cp12-knockout-Mutanten eine Verzögerung bei der Unterdrückung des Calvin-Zyklus während der Dunkelphase erfahren. Nichtsdestotrotz zeigten ntrc-knockout und Cystein-substituierte Mutanten keinen Wachstumsdefekt im Tagesrhythmus, was die Regulation von CP12 während des Tagesrhythmus unwahrscheinlich macht. Stattdessen kann die Redox-Regulation von CP12 während des Tageszyklus durch das Ferredoxin-Thioredoxin-System erfolgen. Zusammenfassend konnte in dieser Studie abweichend von früheren Studien festgestellt werden, dass die NTRC-vermittelte Kälteakklimatisierung redoxabhängig ist. Darüber hinaus wurde CP12 als Redoxpartner der NTRC identifiziert, was bisher unentdeckt war. Obwohl sowohl für die NTRC als auch für CP12 eine voneinander unabhängige Rolle in der Kälteakklimatisierung beschrieben wurde, sind die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen dieser Vorgänge noch nicht vollständig verstanden. Dies ist der erste Bericht, der Interaktionen zwischen diesen beiden Proteinen und die Regulierung der Calvin-Zyklus-Enzyme unter Kältestress durch die NTRC über CP12 zeigt.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: CP12, NTRC, Cold Acclimation, Calvin-Benson Cycle, Redox Regulation
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
• Fakultäten: Fakultät für Biologie
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 22. November 2021
• 1. Bericht­erstatter:in: Nickelsen, Jörg