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Studien zu Ursprung, Funktion und Sequenzierung von RNA- und DNA-Nukleosiden
Studien zu Ursprung, Funktion und Sequenzierung von RNA- und DNA-Nukleosiden
Studies on the origin, function and sequencing of RNA and DNA nucleosides This work focuses on non-canonical nucleosides and modifications of the RNA and DNA. The study of these central functional entities was conducted in three very different areas: a) prebiotic chemistry of non‑canonical and canonical RNA nucleosides, b) functional studies of extant RNA and DNA modifications, and c) sequencing of DNA cytosine modifications. The studies on prebiotic origins provided insights into possible reaction pathways for the formation of RNA nucleosides on the prebiotic earth. For the first time, compatible syntheses of canonical purine and pyrimidine nucleosides were demonstrated. Moreover, for the non-canonical nucleosides m5C, m5U as well as s2U, foundations for their syntheses under prebiotically plausible conditions were established. The functional studies focused on the central mRNA modification m6A and the DNA modifications mdC, hmdC, fdC and cadC in the hemi‑CpG‑context. Regarding m6A, the first systematic analysis of proteins interacting with m6A was demonstrated. In addition to the identification of many previously unknown protein interactors, also proteins repelled by m6A were identified for the first time. Furthermore, the first known link between an mRNA modification and a disease of the autism spectrum was identified. In the second part of the functional studies, the influence of mdC, hmdC, fdC or cadC on gene expression was investigated, when these modifications were present in the hemi‑CpG‑context. The influence of mdC and hmdC on the one hand, and fdC and cadC on the other hand, was very different: Compared to dC, mdC and hmdC only slightly reduced gene expression. An effect that could be attributed to reduced transcription factor affinity. In contrast, fdC and cadC reduced gene expression increasingly until it came to an almost complete hold. Interestingly, this effect occurred exclusively in combination with TDG-mediated base excision repair (BER) of fdC and cadC. Sequencing of the DNA modifications mdC, hmdC, fdC and cadC can now be performed much more reliably, based on the methods developed in this thesis. This part of my work focussed especially on the challenging sequencing of fdC positions as well as of hemi‑ and hybrid-modified loci in DNA. For this purpose, hairpin constructs were developed to allow strand-specific sequencing of mdC, hmdC, fdC and cadC positions. These constructs were then used in bisulfite sequencing together with a hydroxylamine reagent developed at AK Carell. Thereby, enabling us to develop a method for sequencing fdC with highest accuracy. Initial studies demonstrated the clear superiority of this method over fCAB, currently the most common method for fdC sequencing. Furthermore, reference oligonucleotides, so-called spike‑ins, were developed which can be used in many ways to improve sequencing of dC modifications. In sum, this work has broadened our understanding of the origin of non‑canonical and canonical RNA nucleosides. Furthermore, previously unknown functions of central RNA and DNA modifications were identified. Moreover, methods and techniques for sequencing dC modifications were developed, which provide a basis for further elucidation of the functions of these central functional entities., Im Zentrum dieser Arbeit stehen nicht‑kanonische Nukleoside sowie Modifikationen der RNA und DNA. Die Studie dieser zentralen Funktionsträger erfolgte auf drei sehr unterschiedlichen Gebieten: a) Auf dem Gebiet der präbiotischen Chemie nicht‑kanonischer und kanonischer RNA‑Nukleoside, b) der Funktionsstudien rezenter RNA‑ und DNA‑Modifikationen sowie c) der Sequenzierung von Cytosin‑Modifikationen der DNA. Die Studien zum präbiotischen Ursprung ermöglichten Einblicke in potenzielle Reaktionswege zur Bildung von RNA‑Nukleosiden auf der präbiotischen Erde. So konnten erstmals kompatible Synthesen kanonischer Purin‑ und Pyrimidin-Nukleoside beschrieben werden. Für die nicht‑kanonischen Nukleoside m5C, m5U sowie s2U wurden die Grundlagen für deren Synthese unter präbiotisch plausiblen Bedingungen geschaffen. Im Fokus der Funktionsstudien standen die zentrale mRNA‑Modifikation m6A sowie die DNA‑Modifikationen mdC, hmdC, fdC und cadC im hemi‑CpG-Kontext. Bezüglich m6A gelang die erste systematische Analyse der mit m6A interagierenden Proteine. Neben der Identifikation einer Vielzahl bisher unbekannter m6A‑bindender Proteine, wurden erstmalig auch von m6A abgestoßene Proteine identifiziert. Zudem konnte so die erste bekannte Verbindung zwischen einer mRNA-Modifikation und einer Krankheit des Autismus-Spektrums identifiziert werden. Im zweiten Teil der Funktionsstudien wurde der Einfluss von mdC, hmdC, fdC oder cadC im hemi‑CpG-Kontext auf die Genexpression untersucht. Dabei zeigten mdC und hmdC einerseits, sowie fdC und cadC andererseits, sehr unterschiedliche Einflüsse. Im Vergleich zu dC reduzierten mdC und hmdC die Genexpression nur leicht. Ein Effekt, der sich auf eine gewisse Abstoßung des Transkriptionsfaktors zurückführen ließ. Im Gegensatz dazu reduzierten fdC und cadC die Genexpression zunehmend, bis zum nahezu vollständigen Stillstand. Interessanterweise trat dieser Effekt ausschließlich in Zusammenhang mit TDG‑vermittelter Basenexzisionsreparatur (BER) von fdC und cadC auf. Die Sequenzierung der DNA‑Modifikationen mdC, hmdC, fdC und cadC kann durch die in dieser Arbeit entwickelten Methoden nun deutlich zuverlässiger erfolgen. Der Fokus lag dabei insbesondere auf der anspruchsvollen Sequenzierung von fdC sowie von hemi‑ und hybrid‑modifizierten Positionen der DNA. Dazu wurden zunächst Haarnadel‑Oligonukleotide entwickelt, die eine Sequenzierung von mdC, hmdC, fdC sowie cadC in hemi‑ und hybrid-modifizierten Positionen ermöglichen. Anschließend wurden diese Konstrukte, gemeinsam mit einem im AK Carell entwickelten Hydroxylamin-Reagenz, zur Bisulfit-Sequenzierung eingesetzt. So gelang die Entwicklung einer Methode zur Sequenzierung von fdC mit höchster Genauigkeit. Erste Studien demonstrierten die klare Überlegenheit dieser Methode gegenüber fCAB, der aktuell gebräuchlichsten Methode zur fdC‑Sequenzierung. Darüber hinaus wurden Referenz‑Oligonukleotide entwickelt, sogenannte spike‑ins, die vielfältig zur Verbesserung von Sequenzierungen der dC‑Modifikationen einsetzbar sind. Zusammengenommen konnte mit dieser Arbeit das Verständnis des Ursprungs nicht‑kanonischer und kanonischer RNA‑Nukleoside erweitert werden. Darüber hinaus wurden bisher unbekannte Funktionen zentraler RNA‑ und DNA‑Modifikationen identifiziert. Außerdem wurden Methoden und Techniken zur Sequenzierung von dC‑Modifikationen entwickelt, die eine Grundlage bieten für weitere Aufklärungen der Funktionen dieser zentralen Funktionsträger.
mRNA modifications, DNA modifications, sequencing tools, prebiotic chemistry, non-canonical nucleosides
Rossa, Martin
2021
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Rossa, Martin (2021): Studien zu Ursprung, Funktion und Sequenzierung von RNA- und DNA-Nukleosiden. Dissertation, LMU München: Faculty of Chemistry and Pharmacy
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Abstract

Studies on the origin, function and sequencing of RNA and DNA nucleosides This work focuses on non-canonical nucleosides and modifications of the RNA and DNA. The study of these central functional entities was conducted in three very different areas: a) prebiotic chemistry of non‑canonical and canonical RNA nucleosides, b) functional studies of extant RNA and DNA modifications, and c) sequencing of DNA cytosine modifications. The studies on prebiotic origins provided insights into possible reaction pathways for the formation of RNA nucleosides on the prebiotic earth. For the first time, compatible syntheses of canonical purine and pyrimidine nucleosides were demonstrated. Moreover, for the non-canonical nucleosides m5C, m5U as well as s2U, foundations for their syntheses under prebiotically plausible conditions were established. The functional studies focused on the central mRNA modification m6A and the DNA modifications mdC, hmdC, fdC and cadC in the hemi‑CpG‑context. Regarding m6A, the first systematic analysis of proteins interacting with m6A was demonstrated. In addition to the identification of many previously unknown protein interactors, also proteins repelled by m6A were identified for the first time. Furthermore, the first known link between an mRNA modification and a disease of the autism spectrum was identified. In the second part of the functional studies, the influence of mdC, hmdC, fdC or cadC on gene expression was investigated, when these modifications were present in the hemi‑CpG‑context. The influence of mdC and hmdC on the one hand, and fdC and cadC on the other hand, was very different: Compared to dC, mdC and hmdC only slightly reduced gene expression. An effect that could be attributed to reduced transcription factor affinity. In contrast, fdC and cadC reduced gene expression increasingly until it came to an almost complete hold. Interestingly, this effect occurred exclusively in combination with TDG-mediated base excision repair (BER) of fdC and cadC. Sequencing of the DNA modifications mdC, hmdC, fdC and cadC can now be performed much more reliably, based on the methods developed in this thesis. This part of my work focussed especially on the challenging sequencing of fdC positions as well as of hemi‑ and hybrid-modified loci in DNA. For this purpose, hairpin constructs were developed to allow strand-specific sequencing of mdC, hmdC, fdC and cadC positions. These constructs were then used in bisulfite sequencing together with a hydroxylamine reagent developed at AK Carell. Thereby, enabling us to develop a method for sequencing fdC with highest accuracy. Initial studies demonstrated the clear superiority of this method over fCAB, currently the most common method for fdC sequencing. Furthermore, reference oligonucleotides, so-called spike‑ins, were developed which can be used in many ways to improve sequencing of dC modifications. In sum, this work has broadened our understanding of the origin of non‑canonical and canonical RNA nucleosides. Furthermore, previously unknown functions of central RNA and DNA modifications were identified. Moreover, methods and techniques for sequencing dC modifications were developed, which provide a basis for further elucidation of the functions of these central functional entities.

Abstract

Im Zentrum dieser Arbeit stehen nicht‑kanonische Nukleoside sowie Modifikationen der RNA und DNA. Die Studie dieser zentralen Funktionsträger erfolgte auf drei sehr unterschiedlichen Gebieten: a) Auf dem Gebiet der präbiotischen Chemie nicht‑kanonischer und kanonischer RNA‑Nukleoside, b) der Funktionsstudien rezenter RNA‑ und DNA‑Modifikationen sowie c) der Sequenzierung von Cytosin‑Modifikationen der DNA. Die Studien zum präbiotischen Ursprung ermöglichten Einblicke in potenzielle Reaktionswege zur Bildung von RNA‑Nukleosiden auf der präbiotischen Erde. So konnten erstmals kompatible Synthesen kanonischer Purin‑ und Pyrimidin-Nukleoside beschrieben werden. Für die nicht‑kanonischen Nukleoside m5C, m5U sowie s2U wurden die Grundlagen für deren Synthese unter präbiotisch plausiblen Bedingungen geschaffen. Im Fokus der Funktionsstudien standen die zentrale mRNA‑Modifikation m6A sowie die DNA‑Modifikationen mdC, hmdC, fdC und cadC im hemi‑CpG-Kontext. Bezüglich m6A gelang die erste systematische Analyse der mit m6A interagierenden Proteine. Neben der Identifikation einer Vielzahl bisher unbekannter m6A‑bindender Proteine, wurden erstmalig auch von m6A abgestoßene Proteine identifiziert. Zudem konnte so die erste bekannte Verbindung zwischen einer mRNA-Modifikation und einer Krankheit des Autismus-Spektrums identifiziert werden. Im zweiten Teil der Funktionsstudien wurde der Einfluss von mdC, hmdC, fdC oder cadC im hemi‑CpG-Kontext auf die Genexpression untersucht. Dabei zeigten mdC und hmdC einerseits, sowie fdC und cadC andererseits, sehr unterschiedliche Einflüsse. Im Vergleich zu dC reduzierten mdC und hmdC die Genexpression nur leicht. Ein Effekt, der sich auf eine gewisse Abstoßung des Transkriptionsfaktors zurückführen ließ. Im Gegensatz dazu reduzierten fdC und cadC die Genexpression zunehmend, bis zum nahezu vollständigen Stillstand. Interessanterweise trat dieser Effekt ausschließlich in Zusammenhang mit TDG‑vermittelter Basenexzisionsreparatur (BER) von fdC und cadC auf. Die Sequenzierung der DNA‑Modifikationen mdC, hmdC, fdC und cadC kann durch die in dieser Arbeit entwickelten Methoden nun deutlich zuverlässiger erfolgen. Der Fokus lag dabei insbesondere auf der anspruchsvollen Sequenzierung von fdC sowie von hemi‑ und hybrid‑modifizierten Positionen der DNA. Dazu wurden zunächst Haarnadel‑Oligonukleotide entwickelt, die eine Sequenzierung von mdC, hmdC, fdC sowie cadC in hemi‑ und hybrid-modifizierten Positionen ermöglichen. Anschließend wurden diese Konstrukte, gemeinsam mit einem im AK Carell entwickelten Hydroxylamin-Reagenz, zur Bisulfit-Sequenzierung eingesetzt. So gelang die Entwicklung einer Methode zur Sequenzierung von fdC mit höchster Genauigkeit. Erste Studien demonstrierten die klare Überlegenheit dieser Methode gegenüber fCAB, der aktuell gebräuchlichsten Methode zur fdC‑Sequenzierung. Darüber hinaus wurden Referenz‑Oligonukleotide entwickelt, sogenannte spike‑ins, die vielfältig zur Verbesserung von Sequenzierungen der dC‑Modifikationen einsetzbar sind. Zusammengenommen konnte mit dieser Arbeit das Verständnis des Ursprungs nicht‑kanonischer und kanonischer RNA‑Nukleoside erweitert werden. Darüber hinaus wurden bisher unbekannte Funktionen zentraler RNA‑ und DNA‑Modifikationen identifiziert. Außerdem wurden Methoden und Techniken zur Sequenzierung von dC‑Modifikationen entwickelt, die eine Grundlage bieten für weitere Aufklärungen der Funktionen dieser zentralen Funktionsträger.