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Einsatz einer In-situ-Hybridisierung zum Nachweis von Mycoplasma hyopneumoniae-DNA in Lungen aus der Schlachttierkörperuntersuchung von Schweinen
Einsatz einer In-situ-Hybridisierung zum Nachweis von Mycoplasma hyopneumoniae-DNA in Lungen aus der Schlachttierkörperuntersuchung von Schweinen
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Eignung einer In situ Hybridisierung (ISH) zum Nachweis von 16S rRNA von Mycoplasma (M.) hyopneumoniae im Rahmen der Diagnostik der Enzootischen Pneumonie (EP) an Lungen, welche im Zuge der Schlachttierkörperuntersuchung gewonnen wurden, zu überprüfen. Ein Kernpunkt hierbei sollte sein, mögliche Korrelationen zwischen den Ergebnissen einer qPCR (quantitative polymerase chain reaction) und der Pathomorphologie der EP mit den Befunden einer am Institut für Tierpathologie der Ludwig-Maximilians-Universität München neu etablierten ISH zum Nachweis von M. hyopneumoniae zu finden. Hierfür wurden Lungengewebeproben von 27 Tieren aus einem hessischen Schweinebestand, der vorberichtlich respiratorische Symptome im Sinne einer EP zeigte, untersucht. Im Vorfeld der Arbeit wurden alle Lungengewebeproben mittels qPCR positiv auf M. hyopneumoniae getestet. Außerdem lagen die Ergebnisse der Beurteilung von makroskopischen Lungenläsionen im Zuge der Schlachttierkörperuntersuchung vor. Zusätzlich wurde an den Lungengewebeproben eine ISH durchgeführt. Im Zuge der vorliegenden Arbeit wurden diese Daten durch die Ergebnisse adaptierter Bewertungsschemata, zur Auswertung mikroskopischer Läsionen und zur Erfassung und Taxierung der Signale der ISH, ergänzt. Die Lungen aller Tiere wiesen am Schlachthof pathologische Veränderungen auf und erreichten im Schlachtlungen-Scoring nach MADEC und KOBISCH (1982) zwischen 1 bis 20 (von 24) Punkte. Die größte Ausdehnung wiesen die Läsionen im akzessorischen Lungenlappen und in den Mittellappen auf. Histologisch wurde ein durchschnittlicher Grad von 16,70 ± 3,58 (von 24) Punkten erreicht, bei minimal 9 und maximal 23 Punkten. Im Mittel war die peribronchiale und peribronchioläre Infiltration mit Entzündungszellen am prominentesten ausgeprägt, wohingegen sich Exsudat in den Alveolen am mildesten darstellte. Alle Lungen wiesen eine Hyperplasie des Bronchus-assoziierten lymphatischen Gewebes auf. In den Lungengewebeproben konnte mittels ISH bei 21 Tieren die 16S rRNA von M. hyopneumoniae nachgewiesen werden. ISH-Signale konnten bei allen ISH positiven Lungengewebeproben immer auch auf dem Bronchial- und/oder dem Bronchiolusepithel nachgewiesen werden. Zudem wurden an diesen beiden Lokalisationen die intensivsten Signale beobachtet. Die statistische Auswertung konnte die besondere Gewichtung des Bronchialepithels als Lokalisation für ISH-Signale hervorheben. Der Summenscore der ISH korrelierte signifikant mit der Anzahl mittels qPCR bestimmten M. hyopneumoniae-spezifischen Genomsequenzen (rs= 0,529, p= 0,005). Ebenso korrelierten auch die Signalstärken der ISH in Bronchial- (rs= 0,519, p= 0,006) und Bronchiolusepithel (rs= 0,446, p= 0,020) mit der Menge mittels qPCR bestimmter M. hyopneumoniae-spezifischen Genomsequenzen. Die Sensitivität der ISH lag bei 77,78%. Ein Zusammenhang zwischen dem Nachweis der 16S rRNA von M. hyopneumoniae mittels ISH und den Ergebnissen der Beurteilung von Lungenläsionen im Zuge der Schlachttierkörperuntersuchung oder den histologischen Befunden konnte mit diesem Versuchsaufbau nicht nachgewiesen werden. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die durchgeführte ISH ein praktikables und anwenderfreundliches Verfahren zum intraläsionalen Erregernachweis von M. hyopneumoniae-DNA darstellt und die tatsächliche Erregerlast und deren Lokalisation gut widerspiegelt. Besondere Prädilektionsstellen für ISH-Signale sind hierbei die Epithelien der Bronchien und der Bronchiolen. Eine Korrelation der Ergebnisse der ISH mit makroskopischen oder histologischen Befunden konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Daher erlauben die Ergebnisse einer ISH bei Lungen, welche im Rahmen der Schlachttierkörperuntersuchung gewonnen wurden, keinen Rückschluss auf das Ausmaß der Erkrankung in betroffenen Tieren. Hierfür wären weiterführende Untersuchungen, beispielsweise in akuten Erkrankungsstadien, notwendig., The objective of the present study was to evaluate the ability of an in-situ hybridization (ISH) for the diagnosis of Mycoplasma (M.) hyopneumoniae using samples of M. hyopneumoniae infected pigs which were taken during the lung lesion evaluation at carcass inspection at slaughter. A main point was to find possible correlations between the results of a qPCR (real-time polymerase chain reaction) and pathomorphology with the findings of an ISH for the detection of M. hyopneumoniae newly established at the Institute of Veterinary Pathology, Ludwig-Maximilians-University Munich. For this purpose, lung tissue samples of 27 animals from a pig herd in Hessen, Germany, which showed pre-reportable respiratory symptoms indicative for enzootic pneumonia (EP), were examined. Prior to the work, all lung tissue samples were tested positive for M. hyopneumoniae by qPCR. Furthermore, the results of the assessment of the macroscopic lung lesions in the course of the ante-mortem examination were available. In addition, ISH was performed on the lung tissue samples. In the course of the present work, these data were supplemented by the results of adapted scoring systems, for evaluation of microscopic lesions and for the detection and quantification of signals of ISH. The lungs of all animals showed pathological changes at the lung lesion evaluation during carcass inspection and were scored between 1 to 20 (out of 24) points in the slaughterhouse lung evaluation according to the scoring described by MADEC and KOBISCH (1982). Lesions in the accessory lobe of the lung and in the middle lobes showed the greatest extent. Histologically, an average grade of 16.70 ± 3.58 (out of 24) points was obtained with a minimum of 9 and a maximum of 23 points. On average, peribronchial and peribronchiolar infiltration with inflammatory cells was most prominent, whereas the extension of the exudate in the alveoli was mildest. All lungs showed hyperplasia of bronchus-associated lymphoid tissue. In the lung tissue samples, 16s rRNA of M. hyopneumoniae was detected by ISH in 21 animals. ISH signals could always be detected on the bronchial and/or bronchiolar epithelium in all ISH positive lung tissue samples. Moreover, the most intense signals were observed at these two localizations. Statistical analysis was able to highlight the particular emphasis of the bronchial epithelium as a localization for ISH signals. The sum score of ISH correlated significantly with the bacterial load determined by qPCR (rs= 0.529, p= 0.005). Similarly, signal strengths in bronchus (rs= 0.519, p= 0.006) and bronchiolar epithelium (rs= 0.446, p= 0.020) also correlated with bacterial load. The sensitivity of ISH was 77.78%. No correlation of the ISH results with pathomorphologic findings was demonstrated. The results of the present study demonstrade that the ISH performed is a practical and user-friendly method for intralesional detection of M. hyopneumoniae-DNA and reflects the actual pathogen load and its localization well. Particular predilection sites for ISH signals were the epithelia of the bronchi and bronchioles. However, correlation of ISH results with macroscopic or histologic findings has not been demonstrated. Therefore, the results of the ISH in lungs obtained during carcass examination do not allow conclusions to be drawn regarding the extent of the disease in affected animals. For this, further investigations, for example in acute disease stages, would be necessary.
In-situ-Hybridisierung, Mycoplasma hyopneumoniae
Peters-Lindner, Niklas
2021
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Peters-Lindner, Niklas (2021): Einsatz einer In-situ-Hybridisierung zum Nachweis von Mycoplasma hyopneumoniae-DNA in Lungen aus der Schlachttierkörperuntersuchung von Schweinen. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Eignung einer In situ Hybridisierung (ISH) zum Nachweis von 16S rRNA von Mycoplasma (M.) hyopneumoniae im Rahmen der Diagnostik der Enzootischen Pneumonie (EP) an Lungen, welche im Zuge der Schlachttierkörperuntersuchung gewonnen wurden, zu überprüfen. Ein Kernpunkt hierbei sollte sein, mögliche Korrelationen zwischen den Ergebnissen einer qPCR (quantitative polymerase chain reaction) und der Pathomorphologie der EP mit den Befunden einer am Institut für Tierpathologie der Ludwig-Maximilians-Universität München neu etablierten ISH zum Nachweis von M. hyopneumoniae zu finden. Hierfür wurden Lungengewebeproben von 27 Tieren aus einem hessischen Schweinebestand, der vorberichtlich respiratorische Symptome im Sinne einer EP zeigte, untersucht. Im Vorfeld der Arbeit wurden alle Lungengewebeproben mittels qPCR positiv auf M. hyopneumoniae getestet. Außerdem lagen die Ergebnisse der Beurteilung von makroskopischen Lungenläsionen im Zuge der Schlachttierkörperuntersuchung vor. Zusätzlich wurde an den Lungengewebeproben eine ISH durchgeführt. Im Zuge der vorliegenden Arbeit wurden diese Daten durch die Ergebnisse adaptierter Bewertungsschemata, zur Auswertung mikroskopischer Läsionen und zur Erfassung und Taxierung der Signale der ISH, ergänzt. Die Lungen aller Tiere wiesen am Schlachthof pathologische Veränderungen auf und erreichten im Schlachtlungen-Scoring nach MADEC und KOBISCH (1982) zwischen 1 bis 20 (von 24) Punkte. Die größte Ausdehnung wiesen die Läsionen im akzessorischen Lungenlappen und in den Mittellappen auf. Histologisch wurde ein durchschnittlicher Grad von 16,70 ± 3,58 (von 24) Punkten erreicht, bei minimal 9 und maximal 23 Punkten. Im Mittel war die peribronchiale und peribronchioläre Infiltration mit Entzündungszellen am prominentesten ausgeprägt, wohingegen sich Exsudat in den Alveolen am mildesten darstellte. Alle Lungen wiesen eine Hyperplasie des Bronchus-assoziierten lymphatischen Gewebes auf. In den Lungengewebeproben konnte mittels ISH bei 21 Tieren die 16S rRNA von M. hyopneumoniae nachgewiesen werden. ISH-Signale konnten bei allen ISH positiven Lungengewebeproben immer auch auf dem Bronchial- und/oder dem Bronchiolusepithel nachgewiesen werden. Zudem wurden an diesen beiden Lokalisationen die intensivsten Signale beobachtet. Die statistische Auswertung konnte die besondere Gewichtung des Bronchialepithels als Lokalisation für ISH-Signale hervorheben. Der Summenscore der ISH korrelierte signifikant mit der Anzahl mittels qPCR bestimmten M. hyopneumoniae-spezifischen Genomsequenzen (rs= 0,529, p= 0,005). Ebenso korrelierten auch die Signalstärken der ISH in Bronchial- (rs= 0,519, p= 0,006) und Bronchiolusepithel (rs= 0,446, p= 0,020) mit der Menge mittels qPCR bestimmter M. hyopneumoniae-spezifischen Genomsequenzen. Die Sensitivität der ISH lag bei 77,78%. Ein Zusammenhang zwischen dem Nachweis der 16S rRNA von M. hyopneumoniae mittels ISH und den Ergebnissen der Beurteilung von Lungenläsionen im Zuge der Schlachttierkörperuntersuchung oder den histologischen Befunden konnte mit diesem Versuchsaufbau nicht nachgewiesen werden. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die durchgeführte ISH ein praktikables und anwenderfreundliches Verfahren zum intraläsionalen Erregernachweis von M. hyopneumoniae-DNA darstellt und die tatsächliche Erregerlast und deren Lokalisation gut widerspiegelt. Besondere Prädilektionsstellen für ISH-Signale sind hierbei die Epithelien der Bronchien und der Bronchiolen. Eine Korrelation der Ergebnisse der ISH mit makroskopischen oder histologischen Befunden konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Daher erlauben die Ergebnisse einer ISH bei Lungen, welche im Rahmen der Schlachttierkörperuntersuchung gewonnen wurden, keinen Rückschluss auf das Ausmaß der Erkrankung in betroffenen Tieren. Hierfür wären weiterführende Untersuchungen, beispielsweise in akuten Erkrankungsstadien, notwendig.

Abstract

The objective of the present study was to evaluate the ability of an in-situ hybridization (ISH) for the diagnosis of Mycoplasma (M.) hyopneumoniae using samples of M. hyopneumoniae infected pigs which were taken during the lung lesion evaluation at carcass inspection at slaughter. A main point was to find possible correlations between the results of a qPCR (real-time polymerase chain reaction) and pathomorphology with the findings of an ISH for the detection of M. hyopneumoniae newly established at the Institute of Veterinary Pathology, Ludwig-Maximilians-University Munich. For this purpose, lung tissue samples of 27 animals from a pig herd in Hessen, Germany, which showed pre-reportable respiratory symptoms indicative for enzootic pneumonia (EP), were examined. Prior to the work, all lung tissue samples were tested positive for M. hyopneumoniae by qPCR. Furthermore, the results of the assessment of the macroscopic lung lesions in the course of the ante-mortem examination were available. In addition, ISH was performed on the lung tissue samples. In the course of the present work, these data were supplemented by the results of adapted scoring systems, for evaluation of microscopic lesions and for the detection and quantification of signals of ISH. The lungs of all animals showed pathological changes at the lung lesion evaluation during carcass inspection and were scored between 1 to 20 (out of 24) points in the slaughterhouse lung evaluation according to the scoring described by MADEC and KOBISCH (1982). Lesions in the accessory lobe of the lung and in the middle lobes showed the greatest extent. Histologically, an average grade of 16.70 ± 3.58 (out of 24) points was obtained with a minimum of 9 and a maximum of 23 points. On average, peribronchial and peribronchiolar infiltration with inflammatory cells was most prominent, whereas the extension of the exudate in the alveoli was mildest. All lungs showed hyperplasia of bronchus-associated lymphoid tissue. In the lung tissue samples, 16s rRNA of M. hyopneumoniae was detected by ISH in 21 animals. ISH signals could always be detected on the bronchial and/or bronchiolar epithelium in all ISH positive lung tissue samples. Moreover, the most intense signals were observed at these two localizations. Statistical analysis was able to highlight the particular emphasis of the bronchial epithelium as a localization for ISH signals. The sum score of ISH correlated significantly with the bacterial load determined by qPCR (rs= 0.529, p= 0.005). Similarly, signal strengths in bronchus (rs= 0.519, p= 0.006) and bronchiolar epithelium (rs= 0.446, p= 0.020) also correlated with bacterial load. The sensitivity of ISH was 77.78%. No correlation of the ISH results with pathomorphologic findings was demonstrated. The results of the present study demonstrade that the ISH performed is a practical and user-friendly method for intralesional detection of M. hyopneumoniae-DNA and reflects the actual pathogen load and its localization well. Particular predilection sites for ISH signals were the epithelia of the bronchi and bronchioles. However, correlation of ISH results with macroscopic or histologic findings has not been demonstrated. Therefore, the results of the ISH in lungs obtained during carcass examination do not allow conclusions to be drawn regarding the extent of the disease in affected animals. For this, further investigations, for example in acute disease stages, would be necessary.