Entwicklung und Evaluierung eines Milchprotein-Transkript-Depletionsverfahrens für differentielle Transkriptomanalyse in bovinem Milchdrüsengewebe

Brodhagen, Johanna (2021): Entwicklung und Evaluierung eines Milchprotein-Transkript-Depletionsverfahrens für differentielle Transkriptomanalyse in bovinem Milchdrüsengewebe. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät

Abstract

Wirtschaftliche Verluste durch Kosten für die Prophylaxe, Behandlung erkrankter Tiere, Tierverluste und Einbußen in der Milchproduktion sind Folgen von Euterentzündungen, welche als am häufigsten auftretende Erkrankungen in Milchviehbetrieben gelten (SEEGERS et al., 2003; HALASA et al., 2007; HUIJPS et al., 2008; PIEPERS et al., 2009; FÁVERO et al., 2015; ROLLIN et al., 2015; VAN SOEST et al., 2016). Die Pathogenese und Inzidenz dieser Faktorenkrankheit wird durch die Umgebung, das Pathogen und durch den Wirt beeinflusst (BURVENICH et al., 2003). Neben der gesellschaftspolitischen Bedeutung aufgrund der Tierwohlbeeinträchtigung (BURVENICH et al., 2003) ist auch der steigende Antibiotikaeinsatz, verbunden mit zunehmenden Resistenzen der Bakterienpopulationen (TEUBER, 2001; WALLMANN & HEBERER, 2014), ein Grund für die Zucht widerstandsfähiger Milchrinderpopulationen mit Resistenz gegenüber Mastitiden. Zunehmend wird in der Zucht von Milchrindern nicht nur auf phänotypische Eigenschaften wie Melkbarkeit, Leistung, Fertilität und somatische Zellzahl in der Milch selektiert, sondern auch genomische Informationen werden einbezogen (KUEHN et al., 2008). Um mehr über den genetischen Hintergrund und Zusammenhang von molekularen Mechanismen und pathophysiologischen Vorgängen der Empfänglichkeit gegenüber Euterinfektionen zu erfahren, wurden und werden RNA-Seq-Analysen des bovinen Eutertranskriptoms durchgeführt. Das besonders häufige Auftreten von klinischen Euterentzündungen postpartum, im Zeitraum der frühen Laktation, macht eine Probennahme und Anwendung der RNA-Seq zu diesem Zeitpunkt notwendig (BURVENICH et al., 2003; VANGROENWEGHE et al., 2005; BURVENICH et al., 2007). Jedoch besteht das Eutertranskriptom während der Laktation bis zu 80% (CANOVAS et al., 2014; IBEAGHA-AWEMU et al., 2016; BHAT et al., 2019) aus Transkripten von Genen kodierend für Casein- (CSN1S1, CSN1S2, CSN2 und CSN3) und Molkenproteine (PAEP und LALBA), was eine Identifizierung und Analyse von Genen mit niedrigerem Expressionslevel erschwert. Um eine erhöhte Sequenziertiefe verbunden mit gesteigertem Kosteneinsatz zu umgehen und trotzdem eine präzise Identifizierung weniger stark exprimierter, jedoch für die Regulationsvorgänge im Euter relevanter Transkripte zu ermöglichen (BARTEL, 2004; HE & HANNON, 2004; LAWLESS et al., 2013; YANG et al., 2018), muss der Anteil stark transkribierter Gene im Transkriptom des Euterparenchyms reduziert werden. Es wurde darum eine Methode zur Depletion hoch abundanter Milchproteingen-Transkripte aus dem Transkriptom von bovinem Euterparenchym entwickelt und evaluiert. In dieser Studie wurde das Eutergewebe dreier Holstein-Friesian-Erstkalbinnen, aus jeweils einem Euterviertel mit einer E. coli-Infektion und einem Kontrollviertel genutzt. Zur gezielten Entfernung der hoch exprimierten Zieltranskripte kamen Oligonukleotide, komplementär für Sequenzen nahe des 3’Endes dieser Transkripte zum Einsatz. Nach der Hybridisierung der DNA-Nukleotide an die Ziel-RNA wurde eine doppelstrangspezifische RNase H zum Verdau verwendet. Folglich kam es zur Deadenylierung der Milchproteingen-Transkripte. Im anschließenden Schritt der Poly(A)-Selektion wurden diese Transkripte aus dem Pool der Gesamt-RNA entfernt und standen für eine anschließende Umschreibung in cDNA-Bibliotheken und differentielle RNA-Seq-Analyse nicht mehr zur Verfügung. Mit dieser entwickelten Methode ist es gelungen, den Anteil von Milchproteingen-Transkripten in den Proben von durchschnittlich 61% in Eutervierteln ohne Infektion auf bis zu durchschnittlich 24% zu reduzieren. Infiziertes Parenchym wies durchschnittlich 30% stark exprimierte Transkripte auf, was durch die Anwendung der Depletion im Durchschnitt auf bis zu 9% reduziert werden konnte. Zur Bestätigung der verbesserten Sensitivität der RNA-Seq-Analyse gegenüber niedrig exprimierten Transkripten wurde ein höherer Anteil an signifikant differentiell exprimierten Transkripten beim Vergleich von E. coli infiziertem und nicht-infiziertem Euterviertel durch die Anwendung der Depletionsmethode nachgewiesen. Zusätzlich konnten mehr unbekannte Loci detektiert werden und die durchschnittlichen FPKM-Werte der analysierten Gene stiegen an. Trotzdem kam es zu keinen unerwünschten Verzerrungen in der quantitativen Genexpression oder in biologischen Signaltransduktionsmustern. Die Entwicklung und Evaluierung einer gezielten Depletionsmethode zur Reduzierung des Anteils von stark exprimierten Milchproteingen-Transkripten im Eutertranskriptom ist gelungen und kann in zukünftigen Studien zur Verbesserung der Sensitivität der RNA-Seq-Analyse gegenüber weniger stark transkribierten Genen angewendet werden. Das präzise Detektieren regulatorisch relevanter Gene bei gegebener Sequenziertiefe erleichtert so das Verstehen genetischer Hintergründe der Empfänglichkeit von Milchrindern gegenüber Euterinfektionen. Es ist zu erwarten, dass eine präzisere und kostensparende Analyse des Transkriptoms dazu beiträgt, die Identifizierung von mit Mastitisempfänglichkeit in Verbindung stehenden phänotypischen Merkmalen voranzutreiben. Dies würde eine Identifizierung und Etablierung stabiler Biomarker erleichtern, die die Zucht auf Mastitis resistente Rinderpopulationen unterstützen.

Abstract

Economic losses due to costs for prophylaxis, treatment of infected animals, animal losses and reduced milk production are consequences of mastitis, which is considered the most common disease on dairy farms (SEEGERS et al., 2003; HALASA et al., 2007; HUIJPS et al., 2008; PIEPERS et al., 2009; FÁVERO et al., 2015; ROLLIN et al., 2015; VAN SOEST et al., 2016). The pathogenesis and incidence of this factor disease is influenced by the environment, the pathogen and the host (BURVENICH et al., 2003b). In addition to the socio-political importance, due to the impairment of animal welfare (BURVENICH et al., 2003b), the increasing use of antibiotics, combined with increasing resistances in bacterial populations (TEUBER, 2001; WALLMANN & HEBERER, 2014) is a major motivation for breeding robust dairy cattle with resistance to mastitis. Increasingly, in dairy cattle breeding, not only phenotypic traits such as milkability, performance, fertility and milk somatic cell count are selected for, but genomic information is included (KUEHN et al., 2008). To learn more about the genetic background and relationship between molecular mechanisms and pathophysiological processes of susceptibility to udder infections, RNA-Seq analyses of the bovine udder transcriptome have been and are being performed. The particularly frequent occurrence of clinical udder inflammation postpartum, in the period of early lactation, makes it necessary to sample and apply RNA-Seq at this time (BURVENICH et al., 2003b; VANGROENWEGHE et al., 2005; BURVENICH et al., 2007). However, up to 80% of the udder transcriptome during lactation (CANOVAS et al., 2014; IBEAGHA-AWEMU et al., 2016; BHAT et al., 2019) consists of transcripts from genes encoding casein (CSN1S1, CSN1S2, CSN2 and CSN3) and whey proteins (PAEP and LALBA), which makes it difficult to identify genes with lower expression levels. In order to avoid increased sequencing depth, combined with increased costs, and still allow for the precise identification of less strongly expressed transcripts that are relevant for udder regulation (BARTEL, 2004; HE & HANNON, 2004; LAWLESS et al., 2013; YANG et al., 2018), the proportion of highly abundant transcripts in the udder parenchyma transcriptome must be reduced. Therefore, a method to deplete these highly abundant milk protein gene transcripts from the transcriptome of bovine udder parenchyma was developed and evaluated. In this study, the udder tissue of three Holstein-Friesian heifers, from one udder quarter with E. coli infection and one control quarter each was used. Oligonucleotides complementary to sequences near the 3'end of these transcripts were used to remove the highly expressed target transcripts. After hybridization of the DNA nucleotides to the target RNA a double-strand specific RNase H for digestion was used. As a result, the milk protein gene transcripts were deadenylated. In the subsequent step of poly(A) selection these transcripts were removed from the pool of total RNA and were no longer available for subsequent transcription in cDNA libraries and differential RNA-Seq analysis. With this developed method we were able to reduce the proportion of milk protein gene transcripts in our samples from an average of 61% in udder quarters without infection to an average of 24%. Infected parenchyma showed an average of 30% strongly expressed transcripts, which could be reduced to an average of up to 9%. To show the improved sensitivity of RNA-Seq analysis for lowly expressed transcripts, we detected a higher proportion of significantly differentially expressed transcripts when comparing E. coli infected and uninfected udder quarters when applying the depletion method. Additionally, more unknown loci could be detected and the average FPKM values of the analyzed genes increased. Nevertheless, no unwanted bias in quantitative gene expression or in biological signal transduction pattern was observed. The development and evaluation of a targeted depletion method to reduce the proportion of strongly expressed milk protein gene transcripts in the udder transcriptome was successful and can be applied in future studies to improve the sensitivity of RNA-Seq analysis for less highly transcribed genes. The accurate detection of regulatory relevant genes at a given sequencing depth thus facilitates the understanding of genetic background of the susceptibility of dairy cattle to udder infections. Most likely, a more detailed and cost-saving analysis of the transcriptome will help to identify phenotypic traits associated with mastitis susceptibility. It facilitates the identification and establishment of robust biomarkers that can support the breeding of mastitis resistant cattle.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Depletion, differentielle Transkriptomanalyse, bovines Milchdrüsengewebe, Milchproteine
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 590 Tiere (Zoologie)
• Fakultäten: Tierärztliche Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 6. Februar 2021
• 1. Bericht­erstatter:in: Zerbe, Holm