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Role of a bacterial dynamin-like protein DynA in resistance to environmental stress response
Role of a bacterial dynamin-like protein DynA in resistance to environmental stress response
Many bacterial species contain dynamin-like proteins (DLPs). DLPs show a high level of functional diversification. DynA in Bacillus subtilis is a two-headed DLP, mediating nucleotide-independent membrane tethering in vitro and contributing to the innate immunity of bacteria against membrane stress and phage infection. However, so far, the functional mechanisms of the bacterial DLP are poorly understood. Here, the biochemical characteristics of DynA-induced membrane fusion, the mechanisms of DynA-mediated phage resistance and protection effect to antibiotic treatment. To uncover the biochemical characteristics of DynA-induced membrane fusion, we employed content mixing and lipid mixing assays in reconstituted systems to study if DynA induces membrane full fusion. Further, the individual contribution of its subunits in membrane fusion and the role of GTP hydrolysis of DynA were analysed in detail. Our results based on fluorescence resonance energy transfer (FRET) indicated that DynA could induce aqueous content mixing even in the absence of GTP. Moreover, DynA-induced membrane fusion in vitro was a thermo-promoted slow response and showed phospholipid preferences. The D1 subunit of DynA was crucial for membrane fusion, whereas it cannot stabilize the tethered membrane without the help of the D2 subunit. At low temperatures, GTPase activity promoted dissociation of membrane clusters induced by DynA. Surprisingly, the digestion of DynA after hemifusion mediated an instant rise of content exchange, supporting the assumption that disassembly of DynA is the elemental power for fusion-through-hemifusion. Next, the role of DynA in phage resistance was analyzed. We found that the presence of DynA could delay cell lysis after phage infection, thereby slowing down the release of phage progeny from the host cells. During the process, DynA formed static clusters on the cell membrane. It seems that DynA supports the cell membrane and delays rupture. Using transmission electron microscopy (TEM), the protein structure of DynA in solution was analyzed. DynA likely formed dimers and trimers, showing a four-corner and hexagonal shape. In a screening approach, we searched for novel genes that could have a role in phage defence. A B. subtilis 168 single-gene deletion library was screened. DagK and ypmB were found to be related to bacteriophage resistance. The presence of DagK can help bacteria resist phage attachment, replication, and host cell lysis. And the role of YpmB against bacteriophages needs to be further verified and characterized., Viele Bakterienarten enthalten Dynamin-ähnliche Proteine (DLPs). DLPs weisen ein hohes Maß an funktionaler Diversifikation auf. DynA in Bacillus subtilis ist ein zweiköpfiges DLP, das in vitro die nukleotidunabhängige Membranbindung vermittelt und zur angeborenen Immunität von Bakterien gegen Membranstress und Phageninfektion beiträgt. Bisher sind die Funktionsmechanismen des bakteriellen DLP jedoch kaum bekannt. Hier wurden die biochemischen Eigenschaften der DynA-induzierten Membranfusion, die Mechanismen der DynA-vermittelten Phagenresistenz und die Schutzwirkung gegen Antibiotika in Detail untersucht. Um die biochemischen Eigenschaften der DynA-induzierten Membranfusion aufzudecken, verwendeten wir Inhaltsmischungs- und Lipidmischungsassays in rekonstituierten Systemen, um zu untersuchen, ob DynA die vollständige Membranfusion induziert. Ferner wurden der individuelle Beitrag seiner Untereinheiten zur Membranfusion und die Rolle der GTP-Hydrolyse von DynA detailliert analysiert. Unsere Ergebnisse basierend auf dem Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) zeigten, dass DynA selbst in Abwesenheit von GTP eine Vermischung des Liposomeninhalts induzieren kann. Darüber hinaus war die DynA-induzierte Membranfusion in vitro eine thermisch geförderte langsame Reaktion und zeigte Phospholipidpräferenzen. Die D1-Untereinheit von DynA war entscheidend für die Membranfusion, wohingegen sie die angebundene Membran ohne die Hilfe der D2-Untereinheit nicht stabilisieren kann. Bei niedrigen Temperaturen förderte die GTPase-Aktivität die Dissoziation von durch DynA induzierten Membranclustern. Überraschenderweise vermittelte der Verdau von DynA nach der Hemifusion einen sofortigen Anstieg des Inhaltsaustauschs, was die Annahme stützt, dass die Zerlegung von DynA die elementare Kraft für die Fusion durch Hemifusion ist. Als nächstes wurde die Rolle von DynA bei der Phagenresistenz analysiert. Wir fanden heraus, dass das Vorhandensein von DynA die Zelllyse nach einer Phageninfektion verzögern und dadurch die Freisetzung von Phagennachkommen aus den Wirtszellen verlangsamen kann. Während des Prozesses bildete DynA statische Cluster auf der Zellmembran. Es scheint, dass DynA die Zellmembran unterstützt und den Bruch verzögert. Unter Verwendung eines Transmissionselektronenmikroskops (TEM) wurde die Proteinstruktur von DynA in Lösung analysiert. DynA bildete wahrscheinlich Dimere und Trimere, die eine viereckige und sechseckige Form zeigten. In einem Screening-Ansatz suchten wir nach neuen Genen, die eine Rolle bei der Phagenabwehr spielen könnten. Eine B. subtilis 168-Einzelgen-Deletionsbibliothek wurde gescreent. Es wurde festgestellt, dass dagK und ypmB mit der Bakteriophagenresistenz zusammenhängen. Das Vorhandensein von DagK kann Bakterien helfen, die Anhaftung, und die Replikation zu behindern. Zudem wird die Lyse von Wirtszellen vermindert. Und die Rolle von YpmB gegen Bakteriophagen muss weiter verifiziert und charakterisiert werden.
Not available
Guo, Lijun
2021
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Guo, Lijun (2021): Role of a bacterial dynamin-like protein DynA in resistance to environmental stress response. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Many bacterial species contain dynamin-like proteins (DLPs). DLPs show a high level of functional diversification. DynA in Bacillus subtilis is a two-headed DLP, mediating nucleotide-independent membrane tethering in vitro and contributing to the innate immunity of bacteria against membrane stress and phage infection. However, so far, the functional mechanisms of the bacterial DLP are poorly understood. Here, the biochemical characteristics of DynA-induced membrane fusion, the mechanisms of DynA-mediated phage resistance and protection effect to antibiotic treatment. To uncover the biochemical characteristics of DynA-induced membrane fusion, we employed content mixing and lipid mixing assays in reconstituted systems to study if DynA induces membrane full fusion. Further, the individual contribution of its subunits in membrane fusion and the role of GTP hydrolysis of DynA were analysed in detail. Our results based on fluorescence resonance energy transfer (FRET) indicated that DynA could induce aqueous content mixing even in the absence of GTP. Moreover, DynA-induced membrane fusion in vitro was a thermo-promoted slow response and showed phospholipid preferences. The D1 subunit of DynA was crucial for membrane fusion, whereas it cannot stabilize the tethered membrane without the help of the D2 subunit. At low temperatures, GTPase activity promoted dissociation of membrane clusters induced by DynA. Surprisingly, the digestion of DynA after hemifusion mediated an instant rise of content exchange, supporting the assumption that disassembly of DynA is the elemental power for fusion-through-hemifusion. Next, the role of DynA in phage resistance was analyzed. We found that the presence of DynA could delay cell lysis after phage infection, thereby slowing down the release of phage progeny from the host cells. During the process, DynA formed static clusters on the cell membrane. It seems that DynA supports the cell membrane and delays rupture. Using transmission electron microscopy (TEM), the protein structure of DynA in solution was analyzed. DynA likely formed dimers and trimers, showing a four-corner and hexagonal shape. In a screening approach, we searched for novel genes that could have a role in phage defence. A B. subtilis 168 single-gene deletion library was screened. DagK and ypmB were found to be related to bacteriophage resistance. The presence of DagK can help bacteria resist phage attachment, replication, and host cell lysis. And the role of YpmB against bacteriophages needs to be further verified and characterized.

Abstract

Viele Bakterienarten enthalten Dynamin-ähnliche Proteine (DLPs). DLPs weisen ein hohes Maß an funktionaler Diversifikation auf. DynA in Bacillus subtilis ist ein zweiköpfiges DLP, das in vitro die nukleotidunabhängige Membranbindung vermittelt und zur angeborenen Immunität von Bakterien gegen Membranstress und Phageninfektion beiträgt. Bisher sind die Funktionsmechanismen des bakteriellen DLP jedoch kaum bekannt. Hier wurden die biochemischen Eigenschaften der DynA-induzierten Membranfusion, die Mechanismen der DynA-vermittelten Phagenresistenz und die Schutzwirkung gegen Antibiotika in Detail untersucht. Um die biochemischen Eigenschaften der DynA-induzierten Membranfusion aufzudecken, verwendeten wir Inhaltsmischungs- und Lipidmischungsassays in rekonstituierten Systemen, um zu untersuchen, ob DynA die vollständige Membranfusion induziert. Ferner wurden der individuelle Beitrag seiner Untereinheiten zur Membranfusion und die Rolle der GTP-Hydrolyse von DynA detailliert analysiert. Unsere Ergebnisse basierend auf dem Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) zeigten, dass DynA selbst in Abwesenheit von GTP eine Vermischung des Liposomeninhalts induzieren kann. Darüber hinaus war die DynA-induzierte Membranfusion in vitro eine thermisch geförderte langsame Reaktion und zeigte Phospholipidpräferenzen. Die D1-Untereinheit von DynA war entscheidend für die Membranfusion, wohingegen sie die angebundene Membran ohne die Hilfe der D2-Untereinheit nicht stabilisieren kann. Bei niedrigen Temperaturen förderte die GTPase-Aktivität die Dissoziation von durch DynA induzierten Membranclustern. Überraschenderweise vermittelte der Verdau von DynA nach der Hemifusion einen sofortigen Anstieg des Inhaltsaustauschs, was die Annahme stützt, dass die Zerlegung von DynA die elementare Kraft für die Fusion durch Hemifusion ist. Als nächstes wurde die Rolle von DynA bei der Phagenresistenz analysiert. Wir fanden heraus, dass das Vorhandensein von DynA die Zelllyse nach einer Phageninfektion verzögern und dadurch die Freisetzung von Phagennachkommen aus den Wirtszellen verlangsamen kann. Während des Prozesses bildete DynA statische Cluster auf der Zellmembran. Es scheint, dass DynA die Zellmembran unterstützt und den Bruch verzögert. Unter Verwendung eines Transmissionselektronenmikroskops (TEM) wurde die Proteinstruktur von DynA in Lösung analysiert. DynA bildete wahrscheinlich Dimere und Trimere, die eine viereckige und sechseckige Form zeigten. In einem Screening-Ansatz suchten wir nach neuen Genen, die eine Rolle bei der Phagenabwehr spielen könnten. Eine B. subtilis 168-Einzelgen-Deletionsbibliothek wurde gescreent. Es wurde festgestellt, dass dagK und ypmB mit der Bakteriophagenresistenz zusammenhängen. Das Vorhandensein von DagK kann Bakterien helfen, die Anhaftung, und die Replikation zu behindern. Zudem wird die Lyse von Wirtszellen vermindert. Und die Rolle von YpmB gegen Bakteriophagen muss weiter verifiziert und charakterisiert werden.