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Mechanoactivation of protein kinases
Mechanoactivation of protein kinases
Zellen fühlen ihre Umgebung, reagieren auf externe Reize und regulieren entsprechend Zelladhäsion, Zellproliferation, Differenzierung, Beweglichkeit und Apoptose. Diese externen Reize umfassen auch mechanische Kräfte die in biochemische Signale umgewandelt werden. Verständnis der zugrundeliegenden molekularen Vorgänge sind ausschlaggebend, um zu erklären wie Kräfte Signaltransduktionswege anstoßen können, um damit eine eindeutige zelluläre Reaktion auszulösen. Mechanoresponsive Proteine ändern ihre Konformation unter der Einwirkung von Kräften und offenbaren dadurch versteckte Bindestellen, die es dem Protein ermöglicht, phosphoryliert zu werden, selbst enzymatisch aktiv zu sein oder Bindepartner von anderen Proteinen zu werden. Von besonderem Interesse ist die Freilegung von katalytisch aktiven Zentren, da diese Signaltransduktionskaskaden auslösen können und damit direkt zelluläres Verhalten steuern. Katalytisch aktive Proteinkinasen sind oft der Startpunkt für Signalkaskaden und es ist zu vermuten, dass autoinhibierte Kinasen so ein Verhalten zeigen können. Das ist der Annahme geschuldet, dass Autoinhibierungsmechanismen als Mittel zum "Kodieren von Mechanosensitivität" in Proteinen genutzt werden können. Dies wurde bereits experimentell für die Titin-Kinase, einem unter Kraft stehenden Muskelprotein, beschrieben. In dieser Arbeit wird das kraftabhängige Verhalten von zwei potentiell kraftaktivierbaren Kinasen, der Myosin-leichte-Ketten-Kinase und der Fokalen Adhäsionskinase mittels in vitro Rasterkraftmikroskopie (AFM) basierter Einzelmolekül-Kraftspektroskopie (EMKS) in Kombination mit in silico Molekulardynamik-Simulationen (MD Simulation) untersucht. Unter Zuhilfenahme von neu entwickelten Anbindungsmethoden für das AFM konnte die Myosin-leichte-Ketten-Kinase (MLKK), eine Serin/Threonin-Kinase mit signifikanter Homologie zur kraftaktivierten Titin-Kinase, untersucht werden. MLKKs Phosphorylierungstätigkeit ist durch einen Pseudosubstratmechanismus reguliert, der das Binden von Substratmolekülen blockiert, die sonst direkt umgesetzt werden würden. Die Bindung von Calcium/Calmodulin veranlasst Konformationsänderungen, die diesen Autoinhibitonsmechanismus lösen und damit die Bindung von Substratmolekülen ermöglicht. Die Termini der MLKK sind zwischen dünnen und dicken Filamenten eingespannt und setzen dadurch die MLKK mechanischen Belastungen aus, die mit dem Rasterkraftmikroskop imitiert werden können. Untersuchung der MLKK mittels AFM basierter EMKS zeigte einheitlich wiederkehrende kraftinduzierte Übergänge zwischen den jeweiligen Konformationszuständen. Diese wurden in Anwesenheit von verschiedenen Liganden und Adenosintriphosphat (ATP)/Adenosindiphosphat (ADP) charakterisiert. So konnte die konformationelle Kraftlandschaft in Zusammenhang mit biochemisch beobachtbaren Zuständen gebracht werden. Dabei konnte auch die aktive Konformation durch Kraft induziert werden, die sonst durch Calcium/Calmodulin ausgelöst wird. Die Interaktion zwischen der Kinasedomäne und der leichten Kette des Myosins konnte auch in Abwesenheit des aktivierenden Calcium/Calmodulins nachgewiesen werden, obwohl das Pseudosubstrat eigentlich die Bindestelle blockieren sollte. Das könnte auf ein Kraftaktivierungsverhalten hinweisen, das Substratbindung erst nach einer mechanischen Entfernung des Pseudosubstrats zulässt. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde mit einem ähnlichen Verfahren die Autoinhibition der Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinase Fokale Adhäsionskinase (FAK) unter dem Einfluss von Kraft gemessen. FAK ist ein Schlüsselregulator von Zelladhäsion, Zellmigration und Zellüberleben. Fokalkontakte sind dichte molekulare Strukturen auf der zytoplasmatischen Seite der Zelle, die die Zelle mit der extrazellulären Matrix verbindet. Aber die Fokalkontakte können auch die auf sie wirkenden Kräfte fühlen und auf sie reagieren. FAK sitzt an diesen Stellen und kann durch Krafteinwirkung auf die, an die Fokalkontakte gekoppelten, Actomyosin-Fasern aktivert werden. Deswegen ist zu vermuten, dass FAK eine zentrale Rolle in der kraftabhängigen Signaltransduktion spielt. Die grundlegenden molekularen Prinzipien, wie hier die Autoinhibition überwunden werden kann, konnten bis jetzt noch nicht entschlüsselt werden. Eine Kombination aus AFM basierter EMKS und MD Simulationen wurde genutzt um festzustellen, ob Kräfte aktivierende Konformationsänderungen in FAK veranlassen können. AFM basierte EMKS zeigte ein vorangestelltes Entfaltungsereignis bei niedriger Kraft, das nach einem Vergleich mit einer offenen, immer aktiven Mutante von FAK als Mechanoaktivierung bestätigt werden konnte. Es ist das erste Mal, dass das für ein Nicht-Muskelenzym gezeigt werden konnte. Die Aktivierung geschieht vor der Entfaltung von FAK bei Kräften, die natürlicherweise in Fokalkontakten auftreten. Zudem konnte ein ATP-abhängiger Wechsel der Entfaltungsreihenfolge der Domänen beobachtet werden. Konformationsänderungen konnten sogar unter der Domänenebene identifiziert werden und mittels alle Atome umfassender MD Simulationen strukturellen Änderungen zugeordnet werden. Das lässt den Schluss zu, dass Aktivierung ohne den Verlust der katalytischen Funktion durch komplettes Entfalten der Kinase stattfinden kann. Daher konnte FERM (4.1-Protein, Ezrin, Radixin, Moesin) als Kraftpuffer und Überlastschalter identifiziert werden, der Aktivierung durch Strecken von FAK zulässt, aber noch einen Sicherheitsrahmen lässt, um die Kinasedomäne vor Entfaltung zu schützen. Diese Ergebnisse sind wegweisend für weitere Einzelmolekülstudien, die direkten Substratumsatz nach der Kraftaktivierung von FAK zeigen können. Für beide Kinasen konnten wir deutliche Hinweise auf Mechanismen finden, wie Autoinhibierungen nicht nur durch biochemische Prozesse, sondern auch mittels Kraft aufgehoben werden können. So konnte der erste Schritt aufgeklärt werden, der dazu benötigt wird, um mechanische Kräfte in biochemische Signalkaskaden umzuwandeln, die letztlich zu einer zellulären Antwort führen. Abgesehen vom grundlegenden Verständnis könnten diese Einblicke die Entwicklung von alternativen Strategien zur Entdeckung von neuartigen Krebsmedikamenten eröffnen, die sowohl katalytische Aktivität, als auch Gerüstfunktionen hemmen., Cells are able to sense and react to physical stimuli in their environment and accordingly adjust adhesion, proliferation, differentiation, motility and apoptosis. These stimuli comprise mechanical force cues that get translated into biochemical signals. Uncovering the underlying mechanical processes that enable this translation is crucial to understand how force can trigger signal transduction pathways leading to a distinct cellular response. Mechanoresponsive proteins typically change their conformation upon force application revealing previously hidden sites that can allow binding, phosphorylation or even exhibit enzymatic activity themselves. Of special interest is the exposure of catalytic sites since they can directly trigger phosphorylation cascades and thereby drive cellular behavior. Since catalytically active protein kinases are often the origin of signaling cascades, a force induced behavior can be hypothesized for autoinhibited kinases. This is due to the assumption that some autoinhibition mechanisms, "as a means of encoding mechanosensitivity", are susceptible to be resolved by force. It was indeed previously observed for titin kinase, a force bearing protein in muscle tissue. In this work the force-dependent behavior of two potentially force-activatable protein kinases, myosin light-chain kinase and focal adhesion kinase, was examined. Their reaction under mechanical load was investigated in vitro by high-throughput atomic force microscopy (AFM) based single-molecule force spectroscopy (SMFS) in combination with in silico molecular dynamic (MD) simulations. Using newly developed tools for AFM attachment, myosin light-chain kinase (MLCK), a serine/threonine-specific protein kinase with significant homology to the force-activated titin kinase, could be probed. MLCKs turnover is regulated by a pseudosubstrate mechanism that blocks substrate binding and thereby inhibits turnover. Binding of Ca2+ loaded calmodulin (Ca2+/CaM) can initiate conformational changes releasing this autoinhibitory mechanism. MLCKs termini span between force bearing thin and thick filaments exposing MLCK to mechanical stress that can be mimicked in an AFM-based SMFS experiment. Probing MLCK by AFM based SMFS showed stable and reproducible force-guided transitions between respective conformational states. These were examined in the presence of various ligands and adenosine triphosphate (ATP)/adenosine diphosphate (ADP). This way, these states in the conformational force landscape could be related to biochemically observed states. In this process also the active conformation could be obtained by force which is otherwise biochemically induced by Ca2+/CaM. The interaction between the kinase domain and the regulatory light chain substrate was identified even in the absence of the activating Ca2+/CaM, where the substrate binding loop should be inaccessibly occupied by the pseudosubstrate sequence. This could indicate a force activation behavior allowing substrate binding after mechanically induced removal of the autoinhibitory regulatory pseudosubstrate region. Building on these results using a similar workflow, the autoinhibition of non-receptor tyrosin kinase focal adhesion kinase (FAK) could be probed dependent on force. FAK is a key regulator of cell adhesion, migration and survival. Focal adhesion complexes are dense molecular structures at the cytoplasmic side of the cell linking them to the extracellular matrix. But focal adhesion sites can also sense and react to force themselves. FAK is localized at these sites and can be activated following force generation caused by actomyosin fibers attached to focal adhesions. This is why FAK is suspected to play a pivotal role in force transduction. However, the basic molecular principles of how the autoinhibition is overcome mechanically have not yet been deciphered. Combining AFM based SMFS and MD simulations the force response of FAK could be probed and assessed whether force can induce activating conformational changes in FAK. AFM based SMFS revealed an initial low force rupture event that could be further verified and assigned to mechanoactivation by comparison with an open and active mutant of FAK. This is a first for a non-muscle enzyme. The activation event occurs prior to FAK unfolding at forces natively occurring at focal adhesions. Also an ATP dependent switch of domain unfolding order could be observed. Even subdomain conformational changes were identified and structural changes were assigned using all-atom MD simulations. This allowed to conclude that activation can happen without the loss of catalytic function due to a complete unfolding of the kinase. Hence FERM (F for 4.1 protein, E for ezrin, R for radixin and M for moesin) could be identified as a buffer and emergency stop switch that allows activation by extension of FAK while maintaining a safety margin of force for saving the kinase domain from unfolding. These results pave the way for further single-molecule investigations directly showing substrate phosphorylation following force application to FAK. For both kinases we could provide significant evidence of how autoinhibition can be overcome not only by biochemical processes but also by force. This deciphers the first step of how mechanical force cues can be translated into a biochemical signal transduction cascade ultimately causing a cellular response. Besides capturing these ground laying rules of mechanotransduction, these insights enable the design of alternative strategies for the discovery of anticancer therapeutics that can both inhibit catalytic and scaffolding functions.
atomic force microscopy, mechanobiology, focal adhesion signaling, protein kinase regulation, single-molecule force spectroscopy
Bauer, Magnus Sebastian
2020
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Bauer, Magnus Sebastian (2020): Mechanoactivation of protein kinases. Dissertation, LMU München: Faculty of Physics
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Abstract

Zellen fühlen ihre Umgebung, reagieren auf externe Reize und regulieren entsprechend Zelladhäsion, Zellproliferation, Differenzierung, Beweglichkeit und Apoptose. Diese externen Reize umfassen auch mechanische Kräfte die in biochemische Signale umgewandelt werden. Verständnis der zugrundeliegenden molekularen Vorgänge sind ausschlaggebend, um zu erklären wie Kräfte Signaltransduktionswege anstoßen können, um damit eine eindeutige zelluläre Reaktion auszulösen. Mechanoresponsive Proteine ändern ihre Konformation unter der Einwirkung von Kräften und offenbaren dadurch versteckte Bindestellen, die es dem Protein ermöglicht, phosphoryliert zu werden, selbst enzymatisch aktiv zu sein oder Bindepartner von anderen Proteinen zu werden. Von besonderem Interesse ist die Freilegung von katalytisch aktiven Zentren, da diese Signaltransduktionskaskaden auslösen können und damit direkt zelluläres Verhalten steuern. Katalytisch aktive Proteinkinasen sind oft der Startpunkt für Signalkaskaden und es ist zu vermuten, dass autoinhibierte Kinasen so ein Verhalten zeigen können. Das ist der Annahme geschuldet, dass Autoinhibierungsmechanismen als Mittel zum "Kodieren von Mechanosensitivität" in Proteinen genutzt werden können. Dies wurde bereits experimentell für die Titin-Kinase, einem unter Kraft stehenden Muskelprotein, beschrieben. In dieser Arbeit wird das kraftabhängige Verhalten von zwei potentiell kraftaktivierbaren Kinasen, der Myosin-leichte-Ketten-Kinase und der Fokalen Adhäsionskinase mittels in vitro Rasterkraftmikroskopie (AFM) basierter Einzelmolekül-Kraftspektroskopie (EMKS) in Kombination mit in silico Molekulardynamik-Simulationen (MD Simulation) untersucht. Unter Zuhilfenahme von neu entwickelten Anbindungsmethoden für das AFM konnte die Myosin-leichte-Ketten-Kinase (MLKK), eine Serin/Threonin-Kinase mit signifikanter Homologie zur kraftaktivierten Titin-Kinase, untersucht werden. MLKKs Phosphorylierungstätigkeit ist durch einen Pseudosubstratmechanismus reguliert, der das Binden von Substratmolekülen blockiert, die sonst direkt umgesetzt werden würden. Die Bindung von Calcium/Calmodulin veranlasst Konformationsänderungen, die diesen Autoinhibitonsmechanismus lösen und damit die Bindung von Substratmolekülen ermöglicht. Die Termini der MLKK sind zwischen dünnen und dicken Filamenten eingespannt und setzen dadurch die MLKK mechanischen Belastungen aus, die mit dem Rasterkraftmikroskop imitiert werden können. Untersuchung der MLKK mittels AFM basierter EMKS zeigte einheitlich wiederkehrende kraftinduzierte Übergänge zwischen den jeweiligen Konformationszuständen. Diese wurden in Anwesenheit von verschiedenen Liganden und Adenosintriphosphat (ATP)/Adenosindiphosphat (ADP) charakterisiert. So konnte die konformationelle Kraftlandschaft in Zusammenhang mit biochemisch beobachtbaren Zuständen gebracht werden. Dabei konnte auch die aktive Konformation durch Kraft induziert werden, die sonst durch Calcium/Calmodulin ausgelöst wird. Die Interaktion zwischen der Kinasedomäne und der leichten Kette des Myosins konnte auch in Abwesenheit des aktivierenden Calcium/Calmodulins nachgewiesen werden, obwohl das Pseudosubstrat eigentlich die Bindestelle blockieren sollte. Das könnte auf ein Kraftaktivierungsverhalten hinweisen, das Substratbindung erst nach einer mechanischen Entfernung des Pseudosubstrats zulässt. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde mit einem ähnlichen Verfahren die Autoinhibition der Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinase Fokale Adhäsionskinase (FAK) unter dem Einfluss von Kraft gemessen. FAK ist ein Schlüsselregulator von Zelladhäsion, Zellmigration und Zellüberleben. Fokalkontakte sind dichte molekulare Strukturen auf der zytoplasmatischen Seite der Zelle, die die Zelle mit der extrazellulären Matrix verbindet. Aber die Fokalkontakte können auch die auf sie wirkenden Kräfte fühlen und auf sie reagieren. FAK sitzt an diesen Stellen und kann durch Krafteinwirkung auf die, an die Fokalkontakte gekoppelten, Actomyosin-Fasern aktivert werden. Deswegen ist zu vermuten, dass FAK eine zentrale Rolle in der kraftabhängigen Signaltransduktion spielt. Die grundlegenden molekularen Prinzipien, wie hier die Autoinhibition überwunden werden kann, konnten bis jetzt noch nicht entschlüsselt werden. Eine Kombination aus AFM basierter EMKS und MD Simulationen wurde genutzt um festzustellen, ob Kräfte aktivierende Konformationsänderungen in FAK veranlassen können. AFM basierte EMKS zeigte ein vorangestelltes Entfaltungsereignis bei niedriger Kraft, das nach einem Vergleich mit einer offenen, immer aktiven Mutante von FAK als Mechanoaktivierung bestätigt werden konnte. Es ist das erste Mal, dass das für ein Nicht-Muskelenzym gezeigt werden konnte. Die Aktivierung geschieht vor der Entfaltung von FAK bei Kräften, die natürlicherweise in Fokalkontakten auftreten. Zudem konnte ein ATP-abhängiger Wechsel der Entfaltungsreihenfolge der Domänen beobachtet werden. Konformationsänderungen konnten sogar unter der Domänenebene identifiziert werden und mittels alle Atome umfassender MD Simulationen strukturellen Änderungen zugeordnet werden. Das lässt den Schluss zu, dass Aktivierung ohne den Verlust der katalytischen Funktion durch komplettes Entfalten der Kinase stattfinden kann. Daher konnte FERM (4.1-Protein, Ezrin, Radixin, Moesin) als Kraftpuffer und Überlastschalter identifiziert werden, der Aktivierung durch Strecken von FAK zulässt, aber noch einen Sicherheitsrahmen lässt, um die Kinasedomäne vor Entfaltung zu schützen. Diese Ergebnisse sind wegweisend für weitere Einzelmolekülstudien, die direkten Substratumsatz nach der Kraftaktivierung von FAK zeigen können. Für beide Kinasen konnten wir deutliche Hinweise auf Mechanismen finden, wie Autoinhibierungen nicht nur durch biochemische Prozesse, sondern auch mittels Kraft aufgehoben werden können. So konnte der erste Schritt aufgeklärt werden, der dazu benötigt wird, um mechanische Kräfte in biochemische Signalkaskaden umzuwandeln, die letztlich zu einer zellulären Antwort führen. Abgesehen vom grundlegenden Verständnis könnten diese Einblicke die Entwicklung von alternativen Strategien zur Entdeckung von neuartigen Krebsmedikamenten eröffnen, die sowohl katalytische Aktivität, als auch Gerüstfunktionen hemmen.

Abstract

Cells are able to sense and react to physical stimuli in their environment and accordingly adjust adhesion, proliferation, differentiation, motility and apoptosis. These stimuli comprise mechanical force cues that get translated into biochemical signals. Uncovering the underlying mechanical processes that enable this translation is crucial to understand how force can trigger signal transduction pathways leading to a distinct cellular response. Mechanoresponsive proteins typically change their conformation upon force application revealing previously hidden sites that can allow binding, phosphorylation or even exhibit enzymatic activity themselves. Of special interest is the exposure of catalytic sites since they can directly trigger phosphorylation cascades and thereby drive cellular behavior. Since catalytically active protein kinases are often the origin of signaling cascades, a force induced behavior can be hypothesized for autoinhibited kinases. This is due to the assumption that some autoinhibition mechanisms, "as a means of encoding mechanosensitivity", are susceptible to be resolved by force. It was indeed previously observed for titin kinase, a force bearing protein in muscle tissue. In this work the force-dependent behavior of two potentially force-activatable protein kinases, myosin light-chain kinase and focal adhesion kinase, was examined. Their reaction under mechanical load was investigated in vitro by high-throughput atomic force microscopy (AFM) based single-molecule force spectroscopy (SMFS) in combination with in silico molecular dynamic (MD) simulations. Using newly developed tools for AFM attachment, myosin light-chain kinase (MLCK), a serine/threonine-specific protein kinase with significant homology to the force-activated titin kinase, could be probed. MLCKs turnover is regulated by a pseudosubstrate mechanism that blocks substrate binding and thereby inhibits turnover. Binding of Ca2+ loaded calmodulin (Ca2+/CaM) can initiate conformational changes releasing this autoinhibitory mechanism. MLCKs termini span between force bearing thin and thick filaments exposing MLCK to mechanical stress that can be mimicked in an AFM-based SMFS experiment. Probing MLCK by AFM based SMFS showed stable and reproducible force-guided transitions between respective conformational states. These were examined in the presence of various ligands and adenosine triphosphate (ATP)/adenosine diphosphate (ADP). This way, these states in the conformational force landscape could be related to biochemically observed states. In this process also the active conformation could be obtained by force which is otherwise biochemically induced by Ca2+/CaM. The interaction between the kinase domain and the regulatory light chain substrate was identified even in the absence of the activating Ca2+/CaM, where the substrate binding loop should be inaccessibly occupied by the pseudosubstrate sequence. This could indicate a force activation behavior allowing substrate binding after mechanically induced removal of the autoinhibitory regulatory pseudosubstrate region. Building on these results using a similar workflow, the autoinhibition of non-receptor tyrosin kinase focal adhesion kinase (FAK) could be probed dependent on force. FAK is a key regulator of cell adhesion, migration and survival. Focal adhesion complexes are dense molecular structures at the cytoplasmic side of the cell linking them to the extracellular matrix. But focal adhesion sites can also sense and react to force themselves. FAK is localized at these sites and can be activated following force generation caused by actomyosin fibers attached to focal adhesions. This is why FAK is suspected to play a pivotal role in force transduction. However, the basic molecular principles of how the autoinhibition is overcome mechanically have not yet been deciphered. Combining AFM based SMFS and MD simulations the force response of FAK could be probed and assessed whether force can induce activating conformational changes in FAK. AFM based SMFS revealed an initial low force rupture event that could be further verified and assigned to mechanoactivation by comparison with an open and active mutant of FAK. This is a first for a non-muscle enzyme. The activation event occurs prior to FAK unfolding at forces natively occurring at focal adhesions. Also an ATP dependent switch of domain unfolding order could be observed. Even subdomain conformational changes were identified and structural changes were assigned using all-atom MD simulations. This allowed to conclude that activation can happen without the loss of catalytic function due to a complete unfolding of the kinase. Hence FERM (F for 4.1 protein, E for ezrin, R for radixin and M for moesin) could be identified as a buffer and emergency stop switch that allows activation by extension of FAK while maintaining a safety margin of force for saving the kinase domain from unfolding. These results pave the way for further single-molecule investigations directly showing substrate phosphorylation following force application to FAK. For both kinases we could provide significant evidence of how autoinhibition can be overcome not only by biochemical processes but also by force. This deciphers the first step of how mechanical force cues can be translated into a biochemical signal transduction cascade ultimately causing a cellular response. Besides capturing these ground laying rules of mechanotransduction, these insights enable the design of alternative strategies for the discovery of anticancer therapeutics that can both inhibit catalytic and scaffolding functions.