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Design principles of cell-free replicators
Design principles of cell-free replicators
Der heilige Gral der synthetischen Biologie ist die Erschaffung einer minimalen Zelle, welche sowohl zu autonomer Selbstreplikation als auch zu natürlicher Evolution befähigt ist. Bereits heute ist es möglich das zentrale Dogma der Molekularbiologie, also die Implementierung des genetischen Codes mittels Transkription-Translation, in vitro zu rekonstruieren. Doch die Kopplung dieses Prozesses mit einem vollständigen DNA-Selbstreplikationssystem war bisher nur auf ein paar Kilobasen (kbp) beschränkt, weit entfernt von den vorgeschlagenen 113 kbp die für eine minimale Zelle nötig wären. In dieser Arbeit wird die Entwicklung einer Plattform für die transkriptions-translations-gekoppelte DNA-Replikation vorgestellt, genannt PURErep, welche in der Lage ist Genome mit der vorhergesagten Größe einer Minimalzelle zu replizieren. Als wichtiger Schritt in Richtung natürlicher Evolution kann sich der hier beschriebene Selbstreplikator pREP über mehrere Generationen fortpflanzen, sowohl in vitro als auch in vivo. PURErep ist modular aufgebaut und frei verfügbar, sodass es mit beliebigen Funktionen erweitert werden kann. Neben der DNA gibt es weitere Komponenten, die zum Selbsterhalt einer Zelle vermehrt werden müssen. Es konnte gezeigt werden, dass PURErep die simultane Co-Expression mehrerer seiner Proteinkomponenten ermöglicht. Diese Faktoren waren in der Lage sich aktiv an der Selbst-Regeneration des Systems beteiligen, was einen wichtigen Schritt in Richtung biochemischer Autonomie darstellt. Weiterhin wurden Möglichkeiten zur Selbstreplikation des komplexen Ribosoms erforscht, einem wesentlichen Bestandteil des Translationsapparates. Die de novo Synthese und Assemblierung solcher Ribosomen wird eine entscheidende Rolle für zukünftige Entwicklungen spielen. Ein weiteres Merkmal von Zellen stellt ihre Hülle dar, die Zellmembran. Eine von Grund auf neu geschaffene Minimalzelle müsste in der Lage sein, eine ähnliche Hülle selbst zu produzieren. Es wurde ein effizientes Konzept zur Selbst-Verkapselung des pREP Replikators entwickelt, welches vollkommen ohne zusätzlichen Energiebedarf auskommt. Es konnte gezeigt werden, dass diese sogenannten DNA-Nanoflowers Kernstrukturen bildeten und sich über Generation hinweg vermehren können. Insgesamt dienen die in dieser Arbeit dargelegten Entwürfe der Weiterentwicklung unabhängiger Selbstreplikatoren, welche vielleicht in der Lage sein werden eines Tages natürliche Zellen zu imitieren., The holy grail of bottom-up synthetic biology is the creation of a minimal cell capable of autonomous self-replication and open-ended Darwinian evolution. Reconstituting molecular biology’s central dogma, the implementation of genetic information via transcription-translation, is already feasible in vitro. Yet coupling this process to a DNA self-replication system has so far been limited to only a few kilobases (kbp), a far cry from the proposed 113 kbp proposed for a minimal cell. This work presents the development of a transcription-translation coupled DNA replication platform, called PURErep, which is capable of replicating DNA genomes approaching the proposed size of a minimal cell. As an important step towards Darwinian evolution, the herein described self-replicator pREP can propagate over several generations, both in vitro and in vivo. PURErep is modular and freely available, so that it can be extended with further functions as desired. In addition to DNA, there are other components that need to be replicated for the self-preservation of a cell. It could be shown that PURErep enables the simultaneous co-expression for several of its protein components. These factors were able to actively participate in the self-regeneration of the system, representing an important hallmark of biochemical autonomy. Furthermore, the self-reproduction of the complex ribosome was investigated, an essential component of the translational apparatus. The de novo synthesis and assembly of such ribosomes will be a crucial step towards future developments. Another feature of cells is their envelope, the cell membrane. A minimal cell created from scratch should be able to produce a similar compartment by itself. An efficient concept for the self-compartmentalization of the pREP replicator has been developed, which requires no additional energy and is entirely based on self-organization. It could be shown that these so-called DNA nanoflowers formed nuclear structures and could reproduce over generations. Overall, the designs laid out in this work serve to further develop independent self-replicators, which may one day be able to mimic a natural cell.
Synbio, Minimal Cell, Origin of Life, DNA Replication, Synthetic Biology
Libicher, Kai
2021
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Libicher, Kai (2021): Design principles of cell-free replicators. Dissertation, LMU München: Faculty of Physics
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Abstract

Der heilige Gral der synthetischen Biologie ist die Erschaffung einer minimalen Zelle, welche sowohl zu autonomer Selbstreplikation als auch zu natürlicher Evolution befähigt ist. Bereits heute ist es möglich das zentrale Dogma der Molekularbiologie, also die Implementierung des genetischen Codes mittels Transkription-Translation, in vitro zu rekonstruieren. Doch die Kopplung dieses Prozesses mit einem vollständigen DNA-Selbstreplikationssystem war bisher nur auf ein paar Kilobasen (kbp) beschränkt, weit entfernt von den vorgeschlagenen 113 kbp die für eine minimale Zelle nötig wären. In dieser Arbeit wird die Entwicklung einer Plattform für die transkriptions-translations-gekoppelte DNA-Replikation vorgestellt, genannt PURErep, welche in der Lage ist Genome mit der vorhergesagten Größe einer Minimalzelle zu replizieren. Als wichtiger Schritt in Richtung natürlicher Evolution kann sich der hier beschriebene Selbstreplikator pREP über mehrere Generationen fortpflanzen, sowohl in vitro als auch in vivo. PURErep ist modular aufgebaut und frei verfügbar, sodass es mit beliebigen Funktionen erweitert werden kann. Neben der DNA gibt es weitere Komponenten, die zum Selbsterhalt einer Zelle vermehrt werden müssen. Es konnte gezeigt werden, dass PURErep die simultane Co-Expression mehrerer seiner Proteinkomponenten ermöglicht. Diese Faktoren waren in der Lage sich aktiv an der Selbst-Regeneration des Systems beteiligen, was einen wichtigen Schritt in Richtung biochemischer Autonomie darstellt. Weiterhin wurden Möglichkeiten zur Selbstreplikation des komplexen Ribosoms erforscht, einem wesentlichen Bestandteil des Translationsapparates. Die de novo Synthese und Assemblierung solcher Ribosomen wird eine entscheidende Rolle für zukünftige Entwicklungen spielen. Ein weiteres Merkmal von Zellen stellt ihre Hülle dar, die Zellmembran. Eine von Grund auf neu geschaffene Minimalzelle müsste in der Lage sein, eine ähnliche Hülle selbst zu produzieren. Es wurde ein effizientes Konzept zur Selbst-Verkapselung des pREP Replikators entwickelt, welches vollkommen ohne zusätzlichen Energiebedarf auskommt. Es konnte gezeigt werden, dass diese sogenannten DNA-Nanoflowers Kernstrukturen bildeten und sich über Generation hinweg vermehren können. Insgesamt dienen die in dieser Arbeit dargelegten Entwürfe der Weiterentwicklung unabhängiger Selbstreplikatoren, welche vielleicht in der Lage sein werden eines Tages natürliche Zellen zu imitieren.

Abstract

The holy grail of bottom-up synthetic biology is the creation of a minimal cell capable of autonomous self-replication and open-ended Darwinian evolution. Reconstituting molecular biology’s central dogma, the implementation of genetic information via transcription-translation, is already feasible in vitro. Yet coupling this process to a DNA self-replication system has so far been limited to only a few kilobases (kbp), a far cry from the proposed 113 kbp proposed for a minimal cell. This work presents the development of a transcription-translation coupled DNA replication platform, called PURErep, which is capable of replicating DNA genomes approaching the proposed size of a minimal cell. As an important step towards Darwinian evolution, the herein described self-replicator pREP can propagate over several generations, both in vitro and in vivo. PURErep is modular and freely available, so that it can be extended with further functions as desired. In addition to DNA, there are other components that need to be replicated for the self-preservation of a cell. It could be shown that PURErep enables the simultaneous co-expression for several of its protein components. These factors were able to actively participate in the self-regeneration of the system, representing an important hallmark of biochemical autonomy. Furthermore, the self-reproduction of the complex ribosome was investigated, an essential component of the translational apparatus. The de novo synthesis and assembly of such ribosomes will be a crucial step towards future developments. Another feature of cells is their envelope, the cell membrane. A minimal cell created from scratch should be able to produce a similar compartment by itself. An efficient concept for the self-compartmentalization of the pREP replicator has been developed, which requires no additional energy and is entirely based on self-organization. It could be shown that these so-called DNA nanoflowers formed nuclear structures and could reproduce over generations. Overall, the designs laid out in this work serve to further develop independent self-replicators, which may one day be able to mimic a natural cell.