Antibodies to myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG): Analysis of the impact of the glycosylation site of MOG for recognition of human autoantibodies and dissection of effector functions of the anti-MOG monoclonal antibody 8-18C5

Martí Fernández, Iris (2020): Antibodies to myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG): Analysis of the impact of the glycosylation site of MOG for recognition of human autoantibodies and dissection of effector functions of the anti-MOG monoclonal antibody 8-18C5. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie

Abstract

Autoantibodies to myelin oligodendrocytes glycoprotein (MOG) are found in a proportion of patients with inflammatory demyelination and are detected with MOG-transfected cells. MOG is a transmembranous glycoprotein displayed on the outside of internodal myelin; its extracellular part forms an IgV-like fold. While the prototype anti-MOG mAb 8-18C5 and polyclonal anti-MOG responses from different mouse strains largely recognize the FG loop of MOG, the human anti-MOG response is more heterogeneous and human MOG-Abs recognizing different epitopes were found to be pathogenic. The first aim of this thesis was to get further insight into details of antigen-recognition by human MOG-Abs focusing on the impact of glycosylation. MOG has one known N-glycosylation site at N31 located in the BC loop linking two beta-sheets. Reactivity towards wild-type MOG and two different aglycosylated was measured using a cell-based assay. Around 60 % of all patients (16/27) showed an altered reactivity to one or both of the mutations. 7 different patterns of recognition of the two glycosylation-deficient mutants by different patients were identified. In 7/27 patients the neutral glycosylation-deficient mutant was recognized stronger. The glycan structures of HEK- and myelin-derived MOG were determined by mass spectrometry. Previous studies from the lab have shown that MOG antibodies from patients are pathogenic by two different effector mechanisms, namely demyelination and enhancement of the activation of MOG-specific T cells, but it is unknown which Fc effector functions, complement activation and FcγR-activation, are linked to which pathomechanisms. The second part of this thesis is imbedded into the bigger aim to link these pathomechanisms to Fc-functions. To this end, the pathogenic mAb 8-18C5 is applied as a model system. A recombinant version of this mAb with a human IgG1 Fc part is used and 10 clones containing 12 different mutations in the Fc part were introduced. These mutations were selected based on previous publications with other recombinant mAbs. These mutated variants of the 8-18C5 were analysed for antigen-recognition, C1q-binding by ELISA, and FcγRIII activation with a reporter cell line. Thereby a panel of Fc variants of the anti-MOG mAb 8-18C5 was generated that differs with respect to C1q-binding and FcγRIII activation. Together, this thesis showed the importance of the glycosylation site of MOG for binding of autoantibodies. The finding that the glycan provides a hindrance for antibody binding in a proportion of patients has implications for development of assays to enhance the sensitivity to detect antibodies to MOG and provided further insight into details of antigen-recognition and extended the known heterogeneity of human autoantibodies against MOG. Moreover, the 8-18C5 variants cloned in this project provide the basis for future in vivo transfer experiments to link Fc effector functions to different aspects of disease pathology triggered by MOG autoantibodies.

Abstract

Autoantikörper gegen Myelin Oligodenrozyten Glykoprotein (MOG) werden bei einer Subgruppe von Patienten mit entzündlicher Demyelinisierung gefunden und mit MOG-transfizierten Zellen detektiert. MOG ist ein transmembranes Glykoprotein, das auf der Außenseite des internodalen Myelin exprimiert wird; sein extrazellulärer Teil bildet eine Immunglobulin-artige Domäne. Während der Prototyp anti-MOG monoklonale Antikörper (mAk) Ab 8-18C5 und die polyklonalen anti-MOG Antikörper von verschiedenen Mäusestämmen vorwiegend die FG-Schleife von MOG erkennen, ist die menschliche anti-MOG Antwort heterogener und es wurde gefunden, dass menschliche MOG-Aks verschiede Epitope erkennen und pathogen sind. Das erste Ziel dieser Doktorarbeit war es, weiteren Einblick in Details der Antigenerkennung der menschlichen MOG-Aks zu erhalten und speziell die Rolle der Glykosylierung zu untersuchen. MOG hat eine bekannte N-Glykosylierungsstelle bei N31 in der BC-Schleife, die zwei beta-sheets verbindet. Die Reaktivität gegenüber Wildtyp MOG und zwei verschiedenen Glykosylierungs-defizienten Mutanten wurde unter Verwendung eines zellbasierten Assays gemessen. Diese Untersuchungen ergaben, dass etwa 60% aller Patienten mit MOG-Aks (16/27) eine veränderte Reaktivität gegenüber einer oder beiden Mutationen zeigten. 7 verschiedene Muster der Antigenerkennung der beiden Glykosylierungs-defizienten Mutanten von verschiedenen Patienten wurden identifiziert. In 7/27 Patienten wurde die neutrale Glykosylierungs-defiziente Mutante stärker erkannt. Die Glykanstrukturen von MOG von transfizierten HEK-Zellen von MOG aus Myelin wurden massenspektrometrisch bestimmt. Frühere Studien aus dem Labor haben gezeigt, dass MOG-Antikörper von Patienten pathogen sind durch zwei verschiedene Effektomechanismen, nämlich Demyelinisierung und Verstärkung der Aktivierung von MOG-spezifischen T-Zellen. Es ist jedoch nicht bekannt welche Fc-Effektorfunktionen, Komplementaktivierung und FcγR-Aktivierung mit welchem Pathomechanismus zusammenhängen. Der zweite Teil dieser Doktorarbeit wird in das größere Ziel eingebettet, herauszufinden, welche Pathomechanismen mit welchen Fc-Funktionen zusammenhängen. Zu diesem Zweck wird der pathogene mAb 8-18C5 als Modellsystem eingesetzt. Eine rekombinante Version dieses mAk mit einem humanen IgG1-FC Teil wird verwendet und 10 Klone mit 12 verschiedenen Mutationen im Fc-Teil wurden eingeführt. Diese Mutationen wurden basierend auf früheren Veröffentlichungen mit andern rekombinanten mAks ausgewählt. Diese mutierten Varianten des 8-18C5 wurden auf Antigenerkennung, C1q-Bindung durch ELISA und FcγRIII-Aktivierung mit einer Reporterzelllinie analysiert. So konnte ein Panel an Varianten des anti-MOG mAks 8-18C5 generiert werden, die sich hinsichtlich Bindung von C1q und Aktivierung von FcγRIII unterscheiden. Zusammengefasst, diese Doktorarbeit zeigte die Bedeutung der Glykosylierungsstelle von MOG für die Bindung von Autoantikörpern. Der Befund, dass das Glycan die Antikörperbindung bei einem Teil der Patienten behindert, hat Auswirkungen auf die Entwicklung von Tests zur Erhöhung der Empfindlichkeit für den Nachweis von Antikörpern gegen MOG und lieferte weiter Einblicke in Einzelheiten der Antigenerkennung und erweiterte die bekannte Heterogenität menschlicher Autoantikörper gegen MOG. Darüber hinaus bilden die in diesem Projekt geklonten 8-18C5 Varianten die Grundlage für zukünftige Transferexperimente, um die Fc-Effektorfunktionen mit verschiedenen Aspekten der durch MOG-Autoantikörper ausgelösten Krankheitspathologie zu verknüpfen.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
• Fakultäten: Fakultät für Biologie
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 1. Dezember 2020
• 1. Bericht­erstatter:in: Enard, Wolfgang