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Dynamics of the Min system in Bacillus subtilis. an analysis using fluorescence and single-molecule localization microscopy
Dynamics of the Min system in Bacillus subtilis. an analysis using fluorescence and single-molecule localization microscopy
Cell division is an essential process and thus under tight spatio-temporal control, which includes identification of the divisional plane. In most bacterial cells, the divisional plane is positioned at the geometrical cell center and its localization is indicated by the tubulin homologue FtsZ. After polymerizing into a ring-like structure (Z-ring), FtsZ will eventually recruit a multi-enzyme complex responsible for cell division, termed “divisome”. Similar to Escherichia coli, the Min system of the Gram-positive soil bacterium Bacillus subtilis was thought to aid in confining FtsZ polymerization to midcell by inhibiting the process close to the poles. Consisting of MinCDJ and the curvature sensing protein DivIVA, the protein network was expected to form a stable, bipolar gradient, in contrast to the oscillating Min system in E. coli. Since the B. subtilis Min system was later also observed to dynamically relocalize to the divisional septum before cytokinesis, we set out to re-characterize the Min system and the dynamic behavior of the individual components MinD, MinJ and DivIVA. In this work, we first constructed functional fluorescent fusions for the Min proteins, encoded in their native, genomic loci. Using fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) studies, we show that all components of the Min system display fast protein recovery at divisional septa, and further affect each other in their dynamics. Moreover, individual protein copy numbers were determined through in-gel fluorescence. Using photoactivated localization microscopy (PALM), we found a majority of Min proteins associated in large protein clusters, occurring frequently along lateral cell membrane, besides the expected polar and septal regions. Based on these data, a minimal reaction-diffusion model was built, confirming the experimental observations during simulations. In conclusion, we propose a new model of the B. subtilis Min system as cell cycle regulator, where a majority of Min proteins resides in dynamic clusters that constantly probe the cell for curvature. Upon septum formation, they partially relocalize to the site of division to aid in disassembly of the divisome and the FtsZ-ring downstream of division. Additionally, a single-particle tracking (SPT) PALM workflow was established for routine usage. This technique was then utilized to analyze and dissect dynamic subpopulations of MinD and DivIVA, where both exhibited an immobile, a slow- and a fast-diffusive subpopulation. Finally, we present an optimized workflow for employing mNeonGreen in bacterial PALM. By controlled and stepwise enhancement of sample-preparation, imaging conditions and post-processing, we demonstrate that mNeonGreen can even be used to resolve dense structures with a localization precision of 25 nm, exemplified by use of DivIVA-mNeonGreen., Da Zellteilung einen für Bakterien lebensnotwendigen Prozess darstellt, wird dieser räumlich und zeitlich streng kontrolliert, was die Identifizierung der korrekten Zellteilungsebene miteinschließt. In Bakterien ist diese Teilungsebene für gewöhnlich in der geometrischen Zellmitte positioniert. Das bakterielle Tubulin-Homolog FtsZ lokalisiert als erstes Protein an dieser zukünftigen Teilungsebene. Dort bildet sie eine aus FtsZ-Filamenten bestehende, ringförmige Struktur (Z-Ring), die hauptverantwortlich für die Rekrutierung des Divisoms ist, ein Multienzymkomplex der die Zellteilung orchestriert. Ähnlich wie Escherichia coli verfügt das Gram-positive Bakterium Bacillus subtilis über Min Proteine. In E. coli verhindert das oszillierende Min System eine Polymerisierung von FtsZ-Filamenten in den polaren Regionen der Zelle und sorgt damit für die korrekte Positionierung des Z-Rings. In B. subtilis besteht das Min Netzwerk aus MinCDJ und DivIVA, einem Protein das in der Lage ist Membrankrümmung zu detektieren. Auch wenn das System in B. subtilis nicht oszilliert, sondern einen scheinbar stabilen, bipolaren Gradienten bildet, wurde dort eine ähnliche Funktion vermutet. Später wurde allerdings beobachtet, dass sich Min Proteine in Bacillus dynamisch zum Teilungsseptum bewegen, sobald sich dieses bildet, was die genannte Rolle in Frage stellte. Aus diesem Grund haben wir in dieser Studie die einzelnen Min Proteine und ihre Dynamik erneut beobachtet und charakterisiert. Zu diesem Zweck wurden zuerst funktionale, fluoreszente Proteinfusionen konstruiert, welche im nativen Genlocus kodiert sind. Diese Fusionen wurden für „fluorescence recovery after photobleaching” (FRAP) Experimente genutzt. Dabei konnten wir zeigen, dass sich alle Min Proteine dynamisch verhalten und dabei gegenseitig beeinflussen. Weiterhin konnten wir durch in-Gel-Fluoreszenz Proteinmengen der einzelnen Min Protein bestimmen. Mithilfe von photoaktivierter Lokalisationsmikroskopie (PALM) konnten wir im nächsten Schritt erkennen, dass sich die Mehrheit der Min Proteine in dynamischen Proteinclustern befindet. Neben der erwarteten Lokalisation nahe der Pole und des Septums wurden diese auch vermehrt an der lateralen Zellwand und im Cytosol beobachtet. Basierend auf diesen Daten wurde ein mathematisches Modell erstellt, welches die experimentellen Beobachtungen simulierte und bestätigte. Aufgrund dieser Erkenntnisse vermuten wir, dass das Min System in B. subtilis die Aufgabe eines Zellzyklus Regulators hat, und eine Neuinitiation der Teilung neben der genutzten Teilungsebene verhindert. Dabei befindet sich die Mehrzahl der Min Proteine in dynamischen Clustern, welche die Zelle nach Membrankrümmung absuchen, und sich in entsprechenden Regionen stabilisieren. Nach der Bildung eines Septums verlagert sich eine Mehrzahl dieser Cluster zur Mitte der Zelle, um nach erfolgter Teilung den Abbau des Zellteilungsapparates und des Z-Ringes zu unterstützen und voranzutreiben. Darüber hinaus wurde ein Protokoll für die Routineanwendung von Einzelpartikelverfolgung (single-particle tracking, SPT) in PALM Experimenten entwickelt und optimiert. Dieses wurde dann zur Analyse und Unterscheidung der dynamischen Subpopulationen von MinD und DivIVA herangezogen. Diese konnten in jeweils drei Untergruppen unterteilt werden: immobile, langsam diffundierende und schnell diffundierende Proteine, wobei MinD das deutlich schnellere der beiden Proteine war. Abschließend wurden im Rahmen dieser Arbeit ein Protokoll für den optimierten Einsatz des fluoreszenten Proteins mNeonGreen in der bakteriellen PAL Mikroskopie erarbeitet. Durch kontrollierte, schrittweise Verbesserung von Probenaufbereitung, Mikroskopie- und Belichtungsparametern sowie kontrolliertem Filtern der Bilddaten konnten wir demonstrieren, dass mNeonGreen sogar für die Rekonstruktion von dichten, zellulären Strukturen in Bakterien geeignet ist. Dabei erreichten wir bei Aufnahmen von DivIVA-mNeonGreen eine Lokalisationspräzision von 25 nm.
Bacillus subtilis, Min system, Photoactivated localization microscopy (PALM), Single-molecule localization microscopy (SMLM), Single-particle tracking (SPT)
Feddersen, Helge
2020
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Feddersen, Helge (2020): Dynamics of the Min system in Bacillus subtilis: an analysis using fluorescence and single-molecule localization microscopy. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Cell division is an essential process and thus under tight spatio-temporal control, which includes identification of the divisional plane. In most bacterial cells, the divisional plane is positioned at the geometrical cell center and its localization is indicated by the tubulin homologue FtsZ. After polymerizing into a ring-like structure (Z-ring), FtsZ will eventually recruit a multi-enzyme complex responsible for cell division, termed “divisome”. Similar to Escherichia coli, the Min system of the Gram-positive soil bacterium Bacillus subtilis was thought to aid in confining FtsZ polymerization to midcell by inhibiting the process close to the poles. Consisting of MinCDJ and the curvature sensing protein DivIVA, the protein network was expected to form a stable, bipolar gradient, in contrast to the oscillating Min system in E. coli. Since the B. subtilis Min system was later also observed to dynamically relocalize to the divisional septum before cytokinesis, we set out to re-characterize the Min system and the dynamic behavior of the individual components MinD, MinJ and DivIVA. In this work, we first constructed functional fluorescent fusions for the Min proteins, encoded in their native, genomic loci. Using fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) studies, we show that all components of the Min system display fast protein recovery at divisional septa, and further affect each other in their dynamics. Moreover, individual protein copy numbers were determined through in-gel fluorescence. Using photoactivated localization microscopy (PALM), we found a majority of Min proteins associated in large protein clusters, occurring frequently along lateral cell membrane, besides the expected polar and septal regions. Based on these data, a minimal reaction-diffusion model was built, confirming the experimental observations during simulations. In conclusion, we propose a new model of the B. subtilis Min system as cell cycle regulator, where a majority of Min proteins resides in dynamic clusters that constantly probe the cell for curvature. Upon septum formation, they partially relocalize to the site of division to aid in disassembly of the divisome and the FtsZ-ring downstream of division. Additionally, a single-particle tracking (SPT) PALM workflow was established for routine usage. This technique was then utilized to analyze and dissect dynamic subpopulations of MinD and DivIVA, where both exhibited an immobile, a slow- and a fast-diffusive subpopulation. Finally, we present an optimized workflow for employing mNeonGreen in bacterial PALM. By controlled and stepwise enhancement of sample-preparation, imaging conditions and post-processing, we demonstrate that mNeonGreen can even be used to resolve dense structures with a localization precision of 25 nm, exemplified by use of DivIVA-mNeonGreen.

Abstract

Da Zellteilung einen für Bakterien lebensnotwendigen Prozess darstellt, wird dieser räumlich und zeitlich streng kontrolliert, was die Identifizierung der korrekten Zellteilungsebene miteinschließt. In Bakterien ist diese Teilungsebene für gewöhnlich in der geometrischen Zellmitte positioniert. Das bakterielle Tubulin-Homolog FtsZ lokalisiert als erstes Protein an dieser zukünftigen Teilungsebene. Dort bildet sie eine aus FtsZ-Filamenten bestehende, ringförmige Struktur (Z-Ring), die hauptverantwortlich für die Rekrutierung des Divisoms ist, ein Multienzymkomplex der die Zellteilung orchestriert. Ähnlich wie Escherichia coli verfügt das Gram-positive Bakterium Bacillus subtilis über Min Proteine. In E. coli verhindert das oszillierende Min System eine Polymerisierung von FtsZ-Filamenten in den polaren Regionen der Zelle und sorgt damit für die korrekte Positionierung des Z-Rings. In B. subtilis besteht das Min Netzwerk aus MinCDJ und DivIVA, einem Protein das in der Lage ist Membrankrümmung zu detektieren. Auch wenn das System in B. subtilis nicht oszilliert, sondern einen scheinbar stabilen, bipolaren Gradienten bildet, wurde dort eine ähnliche Funktion vermutet. Später wurde allerdings beobachtet, dass sich Min Proteine in Bacillus dynamisch zum Teilungsseptum bewegen, sobald sich dieses bildet, was die genannte Rolle in Frage stellte. Aus diesem Grund haben wir in dieser Studie die einzelnen Min Proteine und ihre Dynamik erneut beobachtet und charakterisiert. Zu diesem Zweck wurden zuerst funktionale, fluoreszente Proteinfusionen konstruiert, welche im nativen Genlocus kodiert sind. Diese Fusionen wurden für „fluorescence recovery after photobleaching” (FRAP) Experimente genutzt. Dabei konnten wir zeigen, dass sich alle Min Proteine dynamisch verhalten und dabei gegenseitig beeinflussen. Weiterhin konnten wir durch in-Gel-Fluoreszenz Proteinmengen der einzelnen Min Protein bestimmen. Mithilfe von photoaktivierter Lokalisationsmikroskopie (PALM) konnten wir im nächsten Schritt erkennen, dass sich die Mehrheit der Min Proteine in dynamischen Proteinclustern befindet. Neben der erwarteten Lokalisation nahe der Pole und des Septums wurden diese auch vermehrt an der lateralen Zellwand und im Cytosol beobachtet. Basierend auf diesen Daten wurde ein mathematisches Modell erstellt, welches die experimentellen Beobachtungen simulierte und bestätigte. Aufgrund dieser Erkenntnisse vermuten wir, dass das Min System in B. subtilis die Aufgabe eines Zellzyklus Regulators hat, und eine Neuinitiation der Teilung neben der genutzten Teilungsebene verhindert. Dabei befindet sich die Mehrzahl der Min Proteine in dynamischen Clustern, welche die Zelle nach Membrankrümmung absuchen, und sich in entsprechenden Regionen stabilisieren. Nach der Bildung eines Septums verlagert sich eine Mehrzahl dieser Cluster zur Mitte der Zelle, um nach erfolgter Teilung den Abbau des Zellteilungsapparates und des Z-Ringes zu unterstützen und voranzutreiben. Darüber hinaus wurde ein Protokoll für die Routineanwendung von Einzelpartikelverfolgung (single-particle tracking, SPT) in PALM Experimenten entwickelt und optimiert. Dieses wurde dann zur Analyse und Unterscheidung der dynamischen Subpopulationen von MinD und DivIVA herangezogen. Diese konnten in jeweils drei Untergruppen unterteilt werden: immobile, langsam diffundierende und schnell diffundierende Proteine, wobei MinD das deutlich schnellere der beiden Proteine war. Abschließend wurden im Rahmen dieser Arbeit ein Protokoll für den optimierten Einsatz des fluoreszenten Proteins mNeonGreen in der bakteriellen PAL Mikroskopie erarbeitet. Durch kontrollierte, schrittweise Verbesserung von Probenaufbereitung, Mikroskopie- und Belichtungsparametern sowie kontrolliertem Filtern der Bilddaten konnten wir demonstrieren, dass mNeonGreen sogar für die Rekonstruktion von dichten, zellulären Strukturen in Bakterien geeignet ist. Dabei erreichten wir bei Aufnahmen von DivIVA-mNeonGreen eine Lokalisationspräzision von 25 nm.