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Small regulatory RNAs controlling complex phenotypes in Vibrio cholerae
Small regulatory RNAs controlling complex phenotypes in Vibrio cholerae
Small RNAs (sRNAs) are central regulators of post-transcriptional gene expression in bacteria. In the major human pathogen Vibrio cholerae, > 100 sRNA candidates have recently been identified. However, little is known about their biological functions. In this work, the mRNA target spectra of four sRNAs of V. cholerae, namely VqmR, VadR, MicV, and VrrA were defined and validated using a combination of RNA-sequencing and biochemical methods. Moreover, transcriptional activators of vadR and micV were identified, and the role of all three sRNAs was investigated in the context of diverse phenotypes. Virulence factor production and biofilm formation are two key processes for the pathogenicity of V. cholerae. Both are controlled by bacterial communication systems referred to as quorum sensing (QS), which is based on small signaling molecules called autoinducers (AI). DPO is the latest discovered AI in V. cholerae and an activating ligand of the transcription factor VqmA. In a bound state, VqmA drives the expression of the VqmR sRNA, which was previously described as a repressor of biofilm formation. The present work revealed that VqmR also controls the production of virulence factors in V. cholerae by inhibiting the synthesis of the QS master regulator AphA. Specifically, VqmR uses a third base-pairing site located in the single-stranded region of its Rho-independent terminator loop to block the ribosome binding site of aphA. The two other known AIs of V. cholerae, CAI-1 and AI-2, also regulate aphA expression by a shared signal transduction pathway. Global transcriptome analyses were performed to study the effect of each of the AIs, i.e., CAI-1, AI-2, or DPO, as well as all possible AI combinations on the production of virulence factors and other important QS-controlled phenotypes. A characteristic phenotype of many Vibrios is their curved rod morphology. Recently, the periplasmic polymer CrvA was identified as the first structural determinant of cell curvature in V. cholerae. However, the regulation of crvA remained poorly understood. In this work, the VadR sRNA was shown to be a direct regulator of crvA, and thus, cell curvature. In a genetic screen, the response regulator of the VxrAB two-component system (TCS) was identified as the transcriptional regulator of vadR. VxrAB is activated under cell wall damaging conditions and promotes the synthesis of new peptidoglycan to restore cell envelope homeostasis. The data presented here demonstrate that VadR also plays a central role in the cell envelope stress response by regulating crvA mRNA levels. Further, the majority of the mRNA targets of VadR are biofilm-related, and VadR overexpression strongly inhibited the process of biofilm formation in V. cholerae. Another crucial component of the cell envelope stress response in V. cholerae is the alternative sigma factor σE, which is encoded on the rpoE gene and activated in the presence of misfolded outer membrane β-barrel proteins (OMPs) in the periplasm. The sigma factor σE associates with RNA polymerase and functions by default as a strict activator of gene expression. In V. cholerae, the σE response includes the induction of the VrrA sRNA to downregulate detrimental transcripts during cell envelope stress conditions. This work identified MicV as a second σE-dependent sRNA. MicV and VrrA both repress a shared and a specific set of mRNA targets, thereby forming the repressive arm of the σE response. Shared targets, e.g., ompA and ompT, are regulated by an almost identical seed sequence present in both sRNAs. A highly similar sequence also exists in the seed region of the σE-dependent RybB sRNA from E. coli providing evidence for a conserved base-pairing domain. Overexpression of MicV, VrrA, or RybB, in either V. cholerae or E. coli, resulted in reduced OMP levels. Further, the overexpression of either of these three sRNAs in a V. cholerae rpoE deletion mutant strongly suppressed its sensitivity towards ethanol. In a laboratory selection experiment, using a randomized sRNA library and ethanol to induce the σE response, the sequence matching the putative base-pairing domain of MicV, VrrA, and RybB, was strongly enriched. The most abundant sRNA variants obtained from the selection experiment all repressed the synthesis of OmpA, which was further characterized as the key factor for ethanol resistance in V. cholerae., Kleine RNAs (sRNAs) sind zentrale Regulatoren der post-transkriptionellen Genexpression in Bakterien. In dem bedeutenden humanpathogenen Bakterium Vibrio cholerae wurden vor Kurzem > 100 sRNA-Kandidaten identifiziert. Allerdings ist nur wenig über ihre biologische Funktion bekannt. In dieser Arbeit wurden die mRNA-Zielspektren von vier sRNAs von V. cholerae, nämlich VqmR, VadR, MicV und VrrA unter Verwendung einer Kombination aus RNA-Sequenzierung und biochemischen Methoden definiert und validiert. Darüber hinaus wurden die Transkriptionsaktivatoren von vadR und micV identifiziert und die Rolle aller drei sRNAs im Kontext verschiedener Phänotypen untersucht. Die Produktion von Virulenzfaktoren und die Bildung von Biofilmen sind zwei Schlüsselprozesse für die Pathogenität von V. cholerae. Beide werden von einem bakteriellen Kommunikationssystem gesteuert, das als Quorum Sensing (QS) bezeichnet wird und auf kleinen Signalmolekülen basiert, die als Autoinduktoren (AI) bezeichnet werden. DPO ist der zuletzt entdeckte AI in V. cholerae und ein aktivierender Ligand des Transkriptionsfaktors VqmA. Mit gebundenem DPO-Liganden steuert VqmA die Expression der VqmR sRNA, die zuvor als Repressor der Biofilmbildung beschrieben wurde. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass VqmR auch die Produktion von Virulenzfaktoren in V. cholerae steuert, indem es die Synthese des QS-Hauptregulators AphA hemmt. Dazu verwendet VqmR eine dritte Basenpaarungsstelle, die sich in der einzelsträngigen Region des Rho-unabhängigen Terminators befindet, um die Ribosomenbindungsstelle von aphA zu blockieren. Die beiden anderen bekannten AI von V. cholerae, CAI-1 und AI-2, regulieren ebenfalls die Expression von aphA über einen gemeinsamen Signaltransduktionsweg. Globale Transkriptomanalysen wurden durchgeführt, um die Wirkung jedes AI, also von CAI-1, AI-2 oder DPO, sowie aller möglichen Kombinationen von AI auf die Produktion von Virulenzfaktoren und anderen wichtigen QS-kontrollierten Phänotypen zu untersuchen. Ein charakteristischer Phänotyp vieler Vibrionen ist ihre gekrümmte, stäbchenförmige Morphologie. Kürzlich wurde das periplasmatische Polymer CrvA als erste strukturelle Determinante der Zellkrümmung von V. cholerae identifiziert. Es blieb jedoch ungeklärt, wie crvA reguliert wird. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die VadR sRNA ein direkter Regulator von crvA ist und damit auch einen indirekten Effekt auf die Zellkrümmung hat. In einem genetischen Screen wurde der Antwortregulator des VxrAB-Zweikomponentensystems (TCS) als Transkriptionsregulator von vadR identifiziert. VxrAB wird unter zellwandschädigenden Bedingungen aktiviert und fördert die Synthese von neuem Peptidoglycan, um die Homöostase der Zellhülle wiederherzustellen. Die hier präsentierten Daten zeigen, dass VadR auch eine zentrale Rolle bei der Zellhüllen-Stressreaktion spielt, indem es die crvA mRNA reguliert. Des Weiteren ist die Mehrheit der Ziel-mRNAs von VadR biofilmbezogen, und die Überexpression von VadR inhibierte den Prozess der Biofilmbildung in V. cholerae deutlich. Eine weitere entscheidende Komponente der Zellhüllen-Stressreaktion von V. cholerae ist der alternative Sigma-Faktor σE, der vom rpoE-Gen codiert und in Gegenwart von fehlgefalteten β-Fass-Proteinen der äußeren Membran (OMPs) im Periplasma aktiviert wird. Der Sigma-Faktor σE bindet die RNA-Polymerase und fungiert unausweichlich als strikter Aktivator der Genexpression. Die σE-Antwort von V. cholerae umfasst die Induktion der VrrA sRNA, um die Anzahl an schädlichen Transkripten während Zellhüllstresses zu reduzieren. Diese Arbeit identifizierte MicV als eine zweite σE-abhängige sRNA. MicV und VrrA unterdrücken beide einen gemeinsamen und einen spezifischen Satz von Ziel-mRNAs und bilden so den repressiven Arm der σE-Antwort. Gemeinsame Zieltranskripte, wie z. B. ompA und ompT, werden durch eine nahezu identische „Seed“-Sequenz reguliert, die in beiden sRNAs vorhanden ist. Eine sehr ähnliche Sequenz existiert auch in der „Seed“-Region der σE-abhängigen RybB sRNA in E. coli, was auf eine konservierte Basenpaarungsdomäne hindeutet. Die Überexpression von MicV, VrrA oder RybB in V. cholerae oder E. coli führte zur verringerten Anzahl an OMP Proteinen. Außerdem verringerte die Überexpression jeder der drei sRNAs die Empfindlichkeit einer V. cholerae rpoE-Deletionsmutante gegenüber Ethanol deutlich. In einem Labor-Selektionsexperiment war, unter Einsatz einer randomisierten sRNA-Bibliothek sowie von Ethanol zur Induktion der σE-Antwort, die Sequenz, die mit der mutmaßlichen Basenpaarungsdomäne von MicV, VrrA und RybB übereinstimmt, stark angereichert. Die am häufigsten vorkommenden sRNA-Varianten, die sich aus dem Selektionsexperiment ergaben, unterdrückten alle die Synthese von OmpA, das im weiteren Verlauf der Studie als Schlüsselfaktor für die Ethanolresistenz von V. cholerae charakterisiert wurde.
Vibrio cholerae, small RNAs, quorum sensing
Herzog, Roman
2020
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Herzog, Roman (2020): Small regulatory RNAs controlling complex phenotypes in Vibrio cholerae. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Small RNAs (sRNAs) are central regulators of post-transcriptional gene expression in bacteria. In the major human pathogen Vibrio cholerae, > 100 sRNA candidates have recently been identified. However, little is known about their biological functions. In this work, the mRNA target spectra of four sRNAs of V. cholerae, namely VqmR, VadR, MicV, and VrrA were defined and validated using a combination of RNA-sequencing and biochemical methods. Moreover, transcriptional activators of vadR and micV were identified, and the role of all three sRNAs was investigated in the context of diverse phenotypes. Virulence factor production and biofilm formation are two key processes for the pathogenicity of V. cholerae. Both are controlled by bacterial communication systems referred to as quorum sensing (QS), which is based on small signaling molecules called autoinducers (AI). DPO is the latest discovered AI in V. cholerae and an activating ligand of the transcription factor VqmA. In a bound state, VqmA drives the expression of the VqmR sRNA, which was previously described as a repressor of biofilm formation. The present work revealed that VqmR also controls the production of virulence factors in V. cholerae by inhibiting the synthesis of the QS master regulator AphA. Specifically, VqmR uses a third base-pairing site located in the single-stranded region of its Rho-independent terminator loop to block the ribosome binding site of aphA. The two other known AIs of V. cholerae, CAI-1 and AI-2, also regulate aphA expression by a shared signal transduction pathway. Global transcriptome analyses were performed to study the effect of each of the AIs, i.e., CAI-1, AI-2, or DPO, as well as all possible AI combinations on the production of virulence factors and other important QS-controlled phenotypes. A characteristic phenotype of many Vibrios is their curved rod morphology. Recently, the periplasmic polymer CrvA was identified as the first structural determinant of cell curvature in V. cholerae. However, the regulation of crvA remained poorly understood. In this work, the VadR sRNA was shown to be a direct regulator of crvA, and thus, cell curvature. In a genetic screen, the response regulator of the VxrAB two-component system (TCS) was identified as the transcriptional regulator of vadR. VxrAB is activated under cell wall damaging conditions and promotes the synthesis of new peptidoglycan to restore cell envelope homeostasis. The data presented here demonstrate that VadR also plays a central role in the cell envelope stress response by regulating crvA mRNA levels. Further, the majority of the mRNA targets of VadR are biofilm-related, and VadR overexpression strongly inhibited the process of biofilm formation in V. cholerae. Another crucial component of the cell envelope stress response in V. cholerae is the alternative sigma factor σE, which is encoded on the rpoE gene and activated in the presence of misfolded outer membrane β-barrel proteins (OMPs) in the periplasm. The sigma factor σE associates with RNA polymerase and functions by default as a strict activator of gene expression. In V. cholerae, the σE response includes the induction of the VrrA sRNA to downregulate detrimental transcripts during cell envelope stress conditions. This work identified MicV as a second σE-dependent sRNA. MicV and VrrA both repress a shared and a specific set of mRNA targets, thereby forming the repressive arm of the σE response. Shared targets, e.g., ompA and ompT, are regulated by an almost identical seed sequence present in both sRNAs. A highly similar sequence also exists in the seed region of the σE-dependent RybB sRNA from E. coli providing evidence for a conserved base-pairing domain. Overexpression of MicV, VrrA, or RybB, in either V. cholerae or E. coli, resulted in reduced OMP levels. Further, the overexpression of either of these three sRNAs in a V. cholerae rpoE deletion mutant strongly suppressed its sensitivity towards ethanol. In a laboratory selection experiment, using a randomized sRNA library and ethanol to induce the σE response, the sequence matching the putative base-pairing domain of MicV, VrrA, and RybB, was strongly enriched. The most abundant sRNA variants obtained from the selection experiment all repressed the synthesis of OmpA, which was further characterized as the key factor for ethanol resistance in V. cholerae.

Abstract

Kleine RNAs (sRNAs) sind zentrale Regulatoren der post-transkriptionellen Genexpression in Bakterien. In dem bedeutenden humanpathogenen Bakterium Vibrio cholerae wurden vor Kurzem > 100 sRNA-Kandidaten identifiziert. Allerdings ist nur wenig über ihre biologische Funktion bekannt. In dieser Arbeit wurden die mRNA-Zielspektren von vier sRNAs von V. cholerae, nämlich VqmR, VadR, MicV und VrrA unter Verwendung einer Kombination aus RNA-Sequenzierung und biochemischen Methoden definiert und validiert. Darüber hinaus wurden die Transkriptionsaktivatoren von vadR und micV identifiziert und die Rolle aller drei sRNAs im Kontext verschiedener Phänotypen untersucht. Die Produktion von Virulenzfaktoren und die Bildung von Biofilmen sind zwei Schlüsselprozesse für die Pathogenität von V. cholerae. Beide werden von einem bakteriellen Kommunikationssystem gesteuert, das als Quorum Sensing (QS) bezeichnet wird und auf kleinen Signalmolekülen basiert, die als Autoinduktoren (AI) bezeichnet werden. DPO ist der zuletzt entdeckte AI in V. cholerae und ein aktivierender Ligand des Transkriptionsfaktors VqmA. Mit gebundenem DPO-Liganden steuert VqmA die Expression der VqmR sRNA, die zuvor als Repressor der Biofilmbildung beschrieben wurde. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass VqmR auch die Produktion von Virulenzfaktoren in V. cholerae steuert, indem es die Synthese des QS-Hauptregulators AphA hemmt. Dazu verwendet VqmR eine dritte Basenpaarungsstelle, die sich in der einzelsträngigen Region des Rho-unabhängigen Terminators befindet, um die Ribosomenbindungsstelle von aphA zu blockieren. Die beiden anderen bekannten AI von V. cholerae, CAI-1 und AI-2, regulieren ebenfalls die Expression von aphA über einen gemeinsamen Signaltransduktionsweg. Globale Transkriptomanalysen wurden durchgeführt, um die Wirkung jedes AI, also von CAI-1, AI-2 oder DPO, sowie aller möglichen Kombinationen von AI auf die Produktion von Virulenzfaktoren und anderen wichtigen QS-kontrollierten Phänotypen zu untersuchen. Ein charakteristischer Phänotyp vieler Vibrionen ist ihre gekrümmte, stäbchenförmige Morphologie. Kürzlich wurde das periplasmatische Polymer CrvA als erste strukturelle Determinante der Zellkrümmung von V. cholerae identifiziert. Es blieb jedoch ungeklärt, wie crvA reguliert wird. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die VadR sRNA ein direkter Regulator von crvA ist und damit auch einen indirekten Effekt auf die Zellkrümmung hat. In einem genetischen Screen wurde der Antwortregulator des VxrAB-Zweikomponentensystems (TCS) als Transkriptionsregulator von vadR identifiziert. VxrAB wird unter zellwandschädigenden Bedingungen aktiviert und fördert die Synthese von neuem Peptidoglycan, um die Homöostase der Zellhülle wiederherzustellen. Die hier präsentierten Daten zeigen, dass VadR auch eine zentrale Rolle bei der Zellhüllen-Stressreaktion spielt, indem es die crvA mRNA reguliert. Des Weiteren ist die Mehrheit der Ziel-mRNAs von VadR biofilmbezogen, und die Überexpression von VadR inhibierte den Prozess der Biofilmbildung in V. cholerae deutlich. Eine weitere entscheidende Komponente der Zellhüllen-Stressreaktion von V. cholerae ist der alternative Sigma-Faktor σE, der vom rpoE-Gen codiert und in Gegenwart von fehlgefalteten β-Fass-Proteinen der äußeren Membran (OMPs) im Periplasma aktiviert wird. Der Sigma-Faktor σE bindet die RNA-Polymerase und fungiert unausweichlich als strikter Aktivator der Genexpression. Die σE-Antwort von V. cholerae umfasst die Induktion der VrrA sRNA, um die Anzahl an schädlichen Transkripten während Zellhüllstresses zu reduzieren. Diese Arbeit identifizierte MicV als eine zweite σE-abhängige sRNA. MicV und VrrA unterdrücken beide einen gemeinsamen und einen spezifischen Satz von Ziel-mRNAs und bilden so den repressiven Arm der σE-Antwort. Gemeinsame Zieltranskripte, wie z. B. ompA und ompT, werden durch eine nahezu identische „Seed“-Sequenz reguliert, die in beiden sRNAs vorhanden ist. Eine sehr ähnliche Sequenz existiert auch in der „Seed“-Region der σE-abhängigen RybB sRNA in E. coli, was auf eine konservierte Basenpaarungsdomäne hindeutet. Die Überexpression von MicV, VrrA oder RybB in V. cholerae oder E. coli führte zur verringerten Anzahl an OMP Proteinen. Außerdem verringerte die Überexpression jeder der drei sRNAs die Empfindlichkeit einer V. cholerae rpoE-Deletionsmutante gegenüber Ethanol deutlich. In einem Labor-Selektionsexperiment war, unter Einsatz einer randomisierten sRNA-Bibliothek sowie von Ethanol zur Induktion der σE-Antwort, die Sequenz, die mit der mutmaßlichen Basenpaarungsdomäne von MicV, VrrA und RybB übereinstimmt, stark angereichert. Die am häufigsten vorkommenden sRNA-Varianten, die sich aus dem Selektionsexperiment ergaben, unterdrückten alle die Synthese von OmpA, das im weiteren Verlauf der Studie als Schlüsselfaktor für die Ethanolresistenz von V. cholerae charakterisiert wurde.