Logo Logo
Help
Contact
Switch language to German
Translation elongation factor P and its post-translational modification enzyme EpmA
Translation elongation factor P and its post-translational modification enzyme EpmA
Protein translation is a non-uniform process, whereby especially proline-containing motifs lead to ribosome stalling events. Elongation factor P (EF P) rescues the ribosome by stimulation of peptidyl transfer. The four known subgroups of bacterial EF-Ps either require post-translational modification (PTM) established by EpmABC/EarP/YmfI or are functional without PTM. In Escherichia coli, the aminomutase EpmB converts (S)-α-lysine into (R)-β-lysine, which is subject to a two-step reaction catalyzed by lysyl-tRNA synthetase paralog EpmA. First, (R)-β-lysyl-adenylate is formed, from which the β-lysyl moiety is subsequently transferred to the ε-amino group of lysine 34 of EF P. This thesis focuses on the interplay of EF-P and EpmA which ensures EF P functionality in vivo and was used to modify EF-P with seven unnatural substrates in vitro. To detect PTM status two universal peptide antibodies, nonselective for the bacterial origin of EF-P, were generated and three subtypes of one-dimensional isoelectric focusing were established (native/denaturating horizontal, vertical). EpmA and EF-P protein copy numbers indicated balanced coordination to ensure outright modification status of EF-P during all growth phases, but no mutual regulation. EpmA’s donor substrate promiscuity was pinpointed to permit C6 scaffolds with at least an amino group at α- ((R/S)-α-lysine, 5-hydroxy-(S)-α-lysine), β- ((R/S)-β-lysine, (R)-3-aminocapronic acid) or ε-position (6-aminocapronic acid). In addition, EpmA variant A298G enabled modification of EF-P with (S)-α-ornithine. For the first time, known natural PTMs of EF P were expanded by seven synthetic PTMs. In vitro transcription translation assay demonstrated superiority of (R)-β-lysylation in ribosome rescue, explaining its evolutionary selection. Modification of EF-P with (S)-α-lysine was successfully achieved in vivo, when (R)-β-lysine synthesis was impeded (E. coli ΔepmB) and epmA(_A298G) overexpressed. In Bacillus subtilis, the ratio of unmodified-to-modified EF P varied over time. Out of 13 tested aminotransferase genes dat, epsN, gsaB, ilvK and yhdR are potentially involved in the yet unsolved modification pathway. In summary, the present work not only provides new biochemical insights into the functionalization of EF-P, but also paves the way to modify proteins post-translationally using EpmA., Die Translation von Proteinen ist kein gleichförmiger Prozess. Besonders bei Polyprolinmotiven treten Verzögerungen des Ribosoms auf. Hier übernimmt Elongationsfaktor P (EF-P) eine helfende Funktion und stimuliert den Peptidyltransfer. Die vier bekannten Gruppen von bakteriellen EF-P benötigen entweder posttranslationale Modifikation (PTM) durch EpmABC/EarP/YmfI, oder sind ohne PTM funktional. In Escherichia coli wandelt die Aminomutase EpmB (S)-α-Lysin in (R)-β-Lysin um. Ein Paralog der Lysyl-tRNA-Synthetase, EpmA, katalysiert die folgende zweistufige Reaktion. Erst wird (R)-β-Lysyladenylat gebildet, dessen β-Lysylgruppe dann auf die ε-Aminogruppe von Lysin 34 von EF-P übertragen wird. Diese Dissertation widmet sich dem Zusammenspiel von EF-P und EpmA. Dieses stellt in vivo die Funktion von EF-P sicher, in vitro erlaubt es die Modifikation von EF P mit sieben unnatürlichen Substraten. Zur Detektion des PTM Status wurden zwei universelle Peptidantikörper etabliert, die EF-P unabhängig von dessen bakterieller Herkunft detektieren, sowie drei Formen der eindimensionalen Isoelektrischen Fokussierung (nativ/denaturierend horizontal, vertikal). Die Kopienzahlen von EpmA und EF-P sind aufeinander abgestimmt, um vollständige Modifikation von EF-P in allen Wachstumsphasen sicherzustellen. Sie regulieren sich aber nicht gegenseitig. Die Promiskuität von EpmA erlaubt Donorsubstrate mit C6-Ketten, die zumindest eine Aminogruppe in α- ((R/S)-α-Lysin, 5-Hydroxy-(S)-α-lysin), β- ((R/S)-β-Lysin, (R)-3-Aminohexansäure) oder ε-Position (6-Aminohexansäure) haben. Zusätzlich ermöglicht die Enzymvariante EpmA_A298G (S)-α-Ornithylierung von EF-P. Erstmals konnten so die natürlichen PTMs von EF-P um sieben synthetische PTMs erweitert werden. In vitro Transkriptions/Translations-Assays zeigten die wirkungsvollste Ribosomen-rettung bei (R)-β-lysyliertem EF-P, was dessen evolutionäre Auswahl erklärt. In vivo gelang die Modifikation von EF-P mit (S)-α-Lysin, wenn die Fähigkeit zur (R)-β-Lysinsynthese fehlte (E. coli ΔepmB) und epmA(_A298G) überexprimiert wurde. In Bacillus subtilis variiert das Verhältnis von unmodifiziertem zu modifiziertem EF-P. Von 13 untersuchten Genen, die Aminotransferasen kodieren, sind dat, epsN, gsaB, ilvK und yhdR möglicherweise am ungeklärten Modifikationsweg beteiligt. Zusammengefasst liefert die vorliegende Arbeit nicht nur neue biochemische Einsichten in die Funktionalisierung von EF-P, sondern eröffnet auch einen neuen Weg, Proteine mittels EpmA posttranslational zu modifizieren.
Escherichia coli, translation elongation factor, EF-P, EpmA, post-translational modification
Pfab, Miriam
2020
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Pfab, Miriam (2020): Translation elongation factor P and its post-translational modification enzyme EpmA. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
[img]
Preview
PDF
Pfab_Miriam.pdf

4MB

Abstract

Protein translation is a non-uniform process, whereby especially proline-containing motifs lead to ribosome stalling events. Elongation factor P (EF P) rescues the ribosome by stimulation of peptidyl transfer. The four known subgroups of bacterial EF-Ps either require post-translational modification (PTM) established by EpmABC/EarP/YmfI or are functional without PTM. In Escherichia coli, the aminomutase EpmB converts (S)-α-lysine into (R)-β-lysine, which is subject to a two-step reaction catalyzed by lysyl-tRNA synthetase paralog EpmA. First, (R)-β-lysyl-adenylate is formed, from which the β-lysyl moiety is subsequently transferred to the ε-amino group of lysine 34 of EF P. This thesis focuses on the interplay of EF-P and EpmA which ensures EF P functionality in vivo and was used to modify EF-P with seven unnatural substrates in vitro. To detect PTM status two universal peptide antibodies, nonselective for the bacterial origin of EF-P, were generated and three subtypes of one-dimensional isoelectric focusing were established (native/denaturating horizontal, vertical). EpmA and EF-P protein copy numbers indicated balanced coordination to ensure outright modification status of EF-P during all growth phases, but no mutual regulation. EpmA’s donor substrate promiscuity was pinpointed to permit C6 scaffolds with at least an amino group at α- ((R/S)-α-lysine, 5-hydroxy-(S)-α-lysine), β- ((R/S)-β-lysine, (R)-3-aminocapronic acid) or ε-position (6-aminocapronic acid). In addition, EpmA variant A298G enabled modification of EF-P with (S)-α-ornithine. For the first time, known natural PTMs of EF P were expanded by seven synthetic PTMs. In vitro transcription translation assay demonstrated superiority of (R)-β-lysylation in ribosome rescue, explaining its evolutionary selection. Modification of EF-P with (S)-α-lysine was successfully achieved in vivo, when (R)-β-lysine synthesis was impeded (E. coli ΔepmB) and epmA(_A298G) overexpressed. In Bacillus subtilis, the ratio of unmodified-to-modified EF P varied over time. Out of 13 tested aminotransferase genes dat, epsN, gsaB, ilvK and yhdR are potentially involved in the yet unsolved modification pathway. In summary, the present work not only provides new biochemical insights into the functionalization of EF-P, but also paves the way to modify proteins post-translationally using EpmA.

Abstract

Die Translation von Proteinen ist kein gleichförmiger Prozess. Besonders bei Polyprolinmotiven treten Verzögerungen des Ribosoms auf. Hier übernimmt Elongationsfaktor P (EF-P) eine helfende Funktion und stimuliert den Peptidyltransfer. Die vier bekannten Gruppen von bakteriellen EF-P benötigen entweder posttranslationale Modifikation (PTM) durch EpmABC/EarP/YmfI, oder sind ohne PTM funktional. In Escherichia coli wandelt die Aminomutase EpmB (S)-α-Lysin in (R)-β-Lysin um. Ein Paralog der Lysyl-tRNA-Synthetase, EpmA, katalysiert die folgende zweistufige Reaktion. Erst wird (R)-β-Lysyladenylat gebildet, dessen β-Lysylgruppe dann auf die ε-Aminogruppe von Lysin 34 von EF-P übertragen wird. Diese Dissertation widmet sich dem Zusammenspiel von EF-P und EpmA. Dieses stellt in vivo die Funktion von EF-P sicher, in vitro erlaubt es die Modifikation von EF P mit sieben unnatürlichen Substraten. Zur Detektion des PTM Status wurden zwei universelle Peptidantikörper etabliert, die EF-P unabhängig von dessen bakterieller Herkunft detektieren, sowie drei Formen der eindimensionalen Isoelektrischen Fokussierung (nativ/denaturierend horizontal, vertikal). Die Kopienzahlen von EpmA und EF-P sind aufeinander abgestimmt, um vollständige Modifikation von EF-P in allen Wachstumsphasen sicherzustellen. Sie regulieren sich aber nicht gegenseitig. Die Promiskuität von EpmA erlaubt Donorsubstrate mit C6-Ketten, die zumindest eine Aminogruppe in α- ((R/S)-α-Lysin, 5-Hydroxy-(S)-α-lysin), β- ((R/S)-β-Lysin, (R)-3-Aminohexansäure) oder ε-Position (6-Aminohexansäure) haben. Zusätzlich ermöglicht die Enzymvariante EpmA_A298G (S)-α-Ornithylierung von EF-P. Erstmals konnten so die natürlichen PTMs von EF-P um sieben synthetische PTMs erweitert werden. In vitro Transkriptions/Translations-Assays zeigten die wirkungsvollste Ribosomen-rettung bei (R)-β-lysyliertem EF-P, was dessen evolutionäre Auswahl erklärt. In vivo gelang die Modifikation von EF-P mit (S)-α-Lysin, wenn die Fähigkeit zur (R)-β-Lysinsynthese fehlte (E. coli ΔepmB) und epmA(_A298G) überexprimiert wurde. In Bacillus subtilis variiert das Verhältnis von unmodifiziertem zu modifiziertem EF-P. Von 13 untersuchten Genen, die Aminotransferasen kodieren, sind dat, epsN, gsaB, ilvK und yhdR möglicherweise am ungeklärten Modifikationsweg beteiligt. Zusammengefasst liefert die vorliegende Arbeit nicht nur neue biochemische Einsichten in die Funktionalisierung von EF-P, sondern eröffnet auch einen neuen Weg, Proteine mittels EpmA posttranslational zu modifizieren.