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Development and improvement of next generation sequencing pipelines for mixed and bulk samples of German fauna
Development and improvement of next generation sequencing pipelines for mixed and bulk samples of German fauna
As a relatively new technology, DNA metabarcoding has already shown potential for a wide variety of practical applications. Biodiversity monitoring is a discipline of particular importance currently, as hundreds or thousands of species become extinct each year, and most extant species remain undescribed. Metabarcoding can greatly assist in increasing the speed and decreasing the cost of large-scale biodiversity monitoring campaigns, but development and improvement of techniques involved in the steps of a metabarcoding pipeline, from DNA extraction through taxonomic identification of sequence data, are still needed. Projects presented in this thesis cover a range of applications of DNA metabarcoding, from biodiversity monitoring of terrestrial invertebrates, to forensic entomology, reverse taxonomy, and the quality control of food, beverage, and novel food products. A multi-year biomonitoring survey with a special focus on early detection of invasive and/or pest species was conducted in the largest national park in Europe. Results demonstrate the effectiveness of metabarcoding for characterizing biodiversity patterns and phenologies, with Principal Component Analyses and ANOSIM tests showing a significant difference in BIN compositions between groups of samples taken from inside of versus outside of the park, for each of the two study years (2016 r = 0.2, p = 2e-04; 2018 r = 0.239, p = 1e-04). Results of the same study also provide support for employing multiple methods of DNA extraction from bulk samples (i.e. homogenizing the specimens themselves, and utilization of the preservative ethanol as a source of genetic material), as well as combining multiple reference sequence databases, in order to improve the chances of detecting species of interest. An attempt was made to counter the issue of specimen size bias, by pre-sorting specimens according to size, but was not successful for the smallest specimens. The invasive pest Lymantria dispar (Linnaeus, 1758) was detected in an ethanol-extracted sample, representing the first detection of this species in the Bavarian Forest National Park. In another project, a DNA barcode library was created, with records for 2,453 named species and 5,200 total BINs, whereby metabarcoding sequence clusters were able to be assigned to “dark” taxa, or taxa which have not yet been described, but are known only by BIN or MOTU, in a reverse taxonomic approach. For families containing “dark taxa”, an inverse correlation was discovered between body size and percentage of unnamed taxa (r = -0.41, p = 4e-04). A pilot study in DNA barcoding for forensic entomology resulted in the contribution of 120 high quality COI barcode sequences to the ZSM reference library, with 46 newly added species belonging to 11 orders. Metabarcoding facilitated the characterization of insect material collected on decomposing porcine corpses, with 469 species identified molecularly from HTS data. Metabarcoding of food and brewing yeasts was also performed. It was demonstrated that metabarcoding can be successfully applied as a non-targeted approach to detecting differing species in supposedly pure yeast starter cultures, using the 26S rDNA D1/D2 region of chromosome XII in Saccharomyces spp. All of the work herein contributes to the growing knowledge bases of describing the earth’s biodiversity, as well as, from a practical standpoint, the refinement of methods involved in the process of DNA metabarcoding for molecular taxon identification., Als relativ neue Technologie hat das DNA-Metabarcoding bereits Potenzial für eine Vielzahl praktischer Anwendungen gezeigt. Die Überwachung der biologischen Vielfalt ist derzeit eine Disziplin von besonderer Bedeutung, da jedes Jahr Hunderte oder Tausende von Arten aussterben und die meisten vorhandenen Arten unbeschrieben bleiben. DNA-Metabarcoding kann erheblich dazu beitragen, die Geschwindigkeit zu erhöhen und die Kosten für groß angelegte Kampagnen zur Überwachung der biologischen Vielfalt zu senken. Die Entwicklung und Verbesserung von Techniken, die an den Schritten einer Metabarcodingpipeline von der DNA-Extraktion bis zur taxonomischen Identifizierung von Sequenzdaten beteiligt sind, sind jedoch weiterhin erforderlich. Die in dieser Arbeit vorgestellten Projekte decken eine Reihe von Anwendungen der DNA-Metabarcoding Technologie ab, von der Überwachung der biologischen Vielfalt terrestrischer Wirbelloser über forensische Entomologie, umgekehrter Taxonomie bis hin zur Qualitätskontrolle von Lebensmitteln, Getränken und neuartigen Lebensmitteln. Im größten Nationalpark Europas wurde ein mehrjähriges Biomonitoring-Projekt mit besonderem Schwerpunkt auf der Früherkennung invasiver und / oder Schädlingsarten durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen die Wirksamkeit des DNA-Metabarcodings für die Charakterisierung von Biodiversitätsmustern und -phänologien, wobei Hauptkomponentenanalysen und ANOSIM-Tests einen signifikanten Unterschied in der BIN-Zusammensetzung zwischen Gruppen von Proben zeigen, die innerhalb und außerhalb des Parks für jedes der beiden Studienjahre (2016) entnommen wurden (r = 0,2, p = 2e-04; 2018 r = 0,239, p = 1e-04). Die Ergebnisse derselben Studie unterstützen auch die Anwendung mehrerer Methoden zur DNA-Extraktion aus Massenproben (beziehungsweise Homogenisierung der Proben selbst und Verwendung des Konservierungsmittels Ethanol als Quelle für genetisches Material) sowie die Kombination mehrerer Referenzsequenzdatenbanken, um die Chancen zu verbessern, alle Arten zu entdecken. Es wurde versucht, dem Problem der Abweichung der Probengröße durch Vorsortieren der Proben nach Größe entgegenzuwirken, was jedoch bei den kleinsten Proben nicht erfolgreich war. Der invasive Schädling Lymantria dispar (Linnaeus, 1758) wurde in einer mit Ethanol extrahierten Probe nachgewiesen, was den ersten Nachweis dieser Art im Nationalpark Bayerischer Wald darstellt. In einem anderen Projekt wurde eine DNA-Barcode-Bibliothek mit Aufzeichnungen für 2.453 benannte Arten und insgesamt 5.200 BINs erstellt, wobei Metabarcoding-Sequenzcluster „dunklen“ Taxa oder Taxa zugeordnet werden konnten, die noch nicht beschrieben wurden, aber nur bekannt sind von BIN oder MOTU in einem reverse-taxonomy Ansatz. Für Familien mit „dunklen Taxa“ wurde eine inverse Korrelation zwischen Körpergröße und Prozentsatz unbenannter Taxa entdeckt (r = -0,41, p = 4e-04). Eine Pilotstudie zum DNA-Barcodierung für die forensische Entomologie ergab den Beitrag von 120 hochwertigen COI-Barcode-Sequenzen zur ZSM-Referenzbibliothek, wobei 46 neu hinzugefügte Arten zu 11 Ordnungen gehörten. Das Metabarcoding erleichterte die Charakterisierung von Insektenmaterial, das bei der Zersetzung von Schweinen gesammelt wurde, wobei 469 Arten molekular aus HTS-Daten identifiziert wurden. Metabarcoding von Lebensmitteln und Brauhefen wurde ebenfalls durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass das Metabarcoding erfolgreich als nicht zielgerichteter Ansatz zum Nachweis unterschiedlicher Arten in vermeintlich reinen Hefestarterkulturen unter Verwendung der 26S-rDNA-D1 / D2-Region von Chromosom XII in Saccharomyces spp. angewendet werden kann. Alle hierin enthaltenen Arbeiten tragen zu den wachsenden Wissensgrundlagen zur Beschreibung der biologischen Vielfalt der Erde sowie zur praktischen Verfeinerung der Methoden bei, die am Prozess des DNA-Metabarcodings zur Identifizierung molekularer Taxa beteiligt sind.
DNA, biodiversity, DNA barcoding, metabarcoding, invasive species
Hardulak, Laura A.
2020
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Hardulak, Laura A. (2020): Development and improvement of next generation sequencing pipelines for mixed and bulk samples of German fauna. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

As a relatively new technology, DNA metabarcoding has already shown potential for a wide variety of practical applications. Biodiversity monitoring is a discipline of particular importance currently, as hundreds or thousands of species become extinct each year, and most extant species remain undescribed. Metabarcoding can greatly assist in increasing the speed and decreasing the cost of large-scale biodiversity monitoring campaigns, but development and improvement of techniques involved in the steps of a metabarcoding pipeline, from DNA extraction through taxonomic identification of sequence data, are still needed. Projects presented in this thesis cover a range of applications of DNA metabarcoding, from biodiversity monitoring of terrestrial invertebrates, to forensic entomology, reverse taxonomy, and the quality control of food, beverage, and novel food products. A multi-year biomonitoring survey with a special focus on early detection of invasive and/or pest species was conducted in the largest national park in Europe. Results demonstrate the effectiveness of metabarcoding for characterizing biodiversity patterns and phenologies, with Principal Component Analyses and ANOSIM tests showing a significant difference in BIN compositions between groups of samples taken from inside of versus outside of the park, for each of the two study years (2016 r = 0.2, p = 2e-04; 2018 r = 0.239, p = 1e-04). Results of the same study also provide support for employing multiple methods of DNA extraction from bulk samples (i.e. homogenizing the specimens themselves, and utilization of the preservative ethanol as a source of genetic material), as well as combining multiple reference sequence databases, in order to improve the chances of detecting species of interest. An attempt was made to counter the issue of specimen size bias, by pre-sorting specimens according to size, but was not successful for the smallest specimens. The invasive pest Lymantria dispar (Linnaeus, 1758) was detected in an ethanol-extracted sample, representing the first detection of this species in the Bavarian Forest National Park. In another project, a DNA barcode library was created, with records for 2,453 named species and 5,200 total BINs, whereby metabarcoding sequence clusters were able to be assigned to “dark” taxa, or taxa which have not yet been described, but are known only by BIN or MOTU, in a reverse taxonomic approach. For families containing “dark taxa”, an inverse correlation was discovered between body size and percentage of unnamed taxa (r = -0.41, p = 4e-04). A pilot study in DNA barcoding for forensic entomology resulted in the contribution of 120 high quality COI barcode sequences to the ZSM reference library, with 46 newly added species belonging to 11 orders. Metabarcoding facilitated the characterization of insect material collected on decomposing porcine corpses, with 469 species identified molecularly from HTS data. Metabarcoding of food and brewing yeasts was also performed. It was demonstrated that metabarcoding can be successfully applied as a non-targeted approach to detecting differing species in supposedly pure yeast starter cultures, using the 26S rDNA D1/D2 region of chromosome XII in Saccharomyces spp. All of the work herein contributes to the growing knowledge bases of describing the earth’s biodiversity, as well as, from a practical standpoint, the refinement of methods involved in the process of DNA metabarcoding for molecular taxon identification.

Abstract

Als relativ neue Technologie hat das DNA-Metabarcoding bereits Potenzial für eine Vielzahl praktischer Anwendungen gezeigt. Die Überwachung der biologischen Vielfalt ist derzeit eine Disziplin von besonderer Bedeutung, da jedes Jahr Hunderte oder Tausende von Arten aussterben und die meisten vorhandenen Arten unbeschrieben bleiben. DNA-Metabarcoding kann erheblich dazu beitragen, die Geschwindigkeit zu erhöhen und die Kosten für groß angelegte Kampagnen zur Überwachung der biologischen Vielfalt zu senken. Die Entwicklung und Verbesserung von Techniken, die an den Schritten einer Metabarcodingpipeline von der DNA-Extraktion bis zur taxonomischen Identifizierung von Sequenzdaten beteiligt sind, sind jedoch weiterhin erforderlich. Die in dieser Arbeit vorgestellten Projekte decken eine Reihe von Anwendungen der DNA-Metabarcoding Technologie ab, von der Überwachung der biologischen Vielfalt terrestrischer Wirbelloser über forensische Entomologie, umgekehrter Taxonomie bis hin zur Qualitätskontrolle von Lebensmitteln, Getränken und neuartigen Lebensmitteln. Im größten Nationalpark Europas wurde ein mehrjähriges Biomonitoring-Projekt mit besonderem Schwerpunkt auf der Früherkennung invasiver und / oder Schädlingsarten durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen die Wirksamkeit des DNA-Metabarcodings für die Charakterisierung von Biodiversitätsmustern und -phänologien, wobei Hauptkomponentenanalysen und ANOSIM-Tests einen signifikanten Unterschied in der BIN-Zusammensetzung zwischen Gruppen von Proben zeigen, die innerhalb und außerhalb des Parks für jedes der beiden Studienjahre (2016) entnommen wurden (r = 0,2, p = 2e-04; 2018 r = 0,239, p = 1e-04). Die Ergebnisse derselben Studie unterstützen auch die Anwendung mehrerer Methoden zur DNA-Extraktion aus Massenproben (beziehungsweise Homogenisierung der Proben selbst und Verwendung des Konservierungsmittels Ethanol als Quelle für genetisches Material) sowie die Kombination mehrerer Referenzsequenzdatenbanken, um die Chancen zu verbessern, alle Arten zu entdecken. Es wurde versucht, dem Problem der Abweichung der Probengröße durch Vorsortieren der Proben nach Größe entgegenzuwirken, was jedoch bei den kleinsten Proben nicht erfolgreich war. Der invasive Schädling Lymantria dispar (Linnaeus, 1758) wurde in einer mit Ethanol extrahierten Probe nachgewiesen, was den ersten Nachweis dieser Art im Nationalpark Bayerischer Wald darstellt. In einem anderen Projekt wurde eine DNA-Barcode-Bibliothek mit Aufzeichnungen für 2.453 benannte Arten und insgesamt 5.200 BINs erstellt, wobei Metabarcoding-Sequenzcluster „dunklen“ Taxa oder Taxa zugeordnet werden konnten, die noch nicht beschrieben wurden, aber nur bekannt sind von BIN oder MOTU in einem reverse-taxonomy Ansatz. Für Familien mit „dunklen Taxa“ wurde eine inverse Korrelation zwischen Körpergröße und Prozentsatz unbenannter Taxa entdeckt (r = -0,41, p = 4e-04). Eine Pilotstudie zum DNA-Barcodierung für die forensische Entomologie ergab den Beitrag von 120 hochwertigen COI-Barcode-Sequenzen zur ZSM-Referenzbibliothek, wobei 46 neu hinzugefügte Arten zu 11 Ordnungen gehörten. Das Metabarcoding erleichterte die Charakterisierung von Insektenmaterial, das bei der Zersetzung von Schweinen gesammelt wurde, wobei 469 Arten molekular aus HTS-Daten identifiziert wurden. Metabarcoding von Lebensmitteln und Brauhefen wurde ebenfalls durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass das Metabarcoding erfolgreich als nicht zielgerichteter Ansatz zum Nachweis unterschiedlicher Arten in vermeintlich reinen Hefestarterkulturen unter Verwendung der 26S-rDNA-D1 / D2-Region von Chromosom XII in Saccharomyces spp. angewendet werden kann. Alle hierin enthaltenen Arbeiten tragen zu den wachsenden Wissensgrundlagen zur Beschreibung der biologischen Vielfalt der Erde sowie zur praktischen Verfeinerung der Methoden bei, die am Prozess des DNA-Metabarcodings zur Identifizierung molekularer Taxa beteiligt sind.