The translation elongation factor P in actinobacteria

Pinheiro Damasceno Florentino, Bruno (2020): The translation elongation factor P in actinobacteria. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie

Abstract

The incorporation of consecutive prolines into a nascent peptide chain triggers ribosome stalling and requires rescue via a specific, universally conserved, translation elongation factor – bacterial EF-P and archaeal/eukaryotic a/eIF5A. In Eukarya, Archaea and all bacteria investigated so far, the functionality of this translation elongation factor depends on specific and rather unusual post-translational modifications. Actinobacteria, which includes the genera Corynebacterium, Streptomyces and Mycobacterium is of both medical and economical significance. This work focuses on the EF-P proteins from the most prominent Actinobacteria. Structure, mechanism of action, expression and specific physiological effects in the cells are explored. Proteomic analysis of C. glutamicum revealed that EF-P is required for the translation of proteins involved in amino acid and secondary metabolite production. Analysis of the protein functionality, molecular mass, charge and X-ray crystal structure showed evidence that Actinobacterial EF-P does not require any post-translational modification for activation. While the function and overall 3D structure of this EF-P type is conserved, the β2Ωβ3 loop containing the conserved lysine32 is flanked by two essential prolines (P30 and P34) that rigidify it. Amino acid substitutions that increased the flexibility of this loop completely inhibit EF-P function. This new EF-P subfamily is found in 11% of all bacteria. The genome of C. glutamicum encodes 1,468 polyproline motifs, many of which are found in transcriptional regulators and carbohydrate transporters. The requirement of EF-P for translation of carbohydrate transporters can be a bottleneck in the performance of industrial strains. The EIIGlc - glucose-specific permease of the phosphoenolpyruvate (PEP): sugar phosphotransferase system (PTS) - encoded by ptsG, is the most important glucose uptake system of C. glutamicum. Due to the presence of a polyproline, production of EIIGlc is strongly reduced in the Δefp mutant strain, resulting in a lower glucose uptake rate and growth defect. The polyproline motif is essential for functionality and could not be replaced by any other amino acid sequence in an unbiased random mutagenesis. GntR2, a transcriptional activator of ptsG, is also dependent on EF-P. However, its reduced copy number can be compensated for by other regulators. Analysis of C. glutamicum and S. coelicolor cell lysates revealed that EF-P is upregulated in the early stationary phase, a time point in which Actinobacteria produce and secrete large amounts of amino acids and other secondary metabolites. Evolutionary analysis of polyproline motifs in the proteome of S. coelicolor provided evidence of evolutionary selection against translational stalling in the core proteome, but not in the enzymes responsible for secondary metabolite production. Proteins essential for antibiotics production contain up to 15 polyproline motifs and without EF-P, production of coelimycin P1, undecylprodigiosin and actinorhodin were only a fraction of the parental strain. This thesis provides evidence that EF-P is active without post-translational modifications in the most prominent Actinobacteria. Moreover, it acts as a bottleneck in the translation of carbohydrate transporters and enzymes of secondary metabolism.

Abstract

Der Einbau konsekutiver Proline in eine entstehende Peptidkette führt zu einem ungewollten Stopp der Translation am Ribosom. Dieser Arrest kann aufgehoben werden durch einen spezifischen, universell konservierten Translations-Elongationsfaktor - bakterielles EF-P und archäales/eukaryotisches a/eIF5A. Bei Eukaryoten, Archaeen und allen bisher untersuchten Bakterien hängt die Funktionalität des Translations-Elongationsfaktors von spezifischen und eher ungewöhnlichen post-translationalen Modifikationen ab. Actinobacteria, zu denen die Gattungen Corynebacterium, Streptomyces und Mycobacterium gehören, sind sowohl von medizinischer als auch von wirtschaftlicher Bedeutung. Diese Arbeit fokussiert sich auf die EF-P-Proteine der prominentesten Actinobacteria, untersucht werden ihre Struktur, ihren Funktionsmechanismus, Expression und spezifische physiologische Effekte. Die Proteomanalyse von C. glutamicum ergab, dass EF-P für die Translation von Proteinen erforderlich ist, welche an der Produktion von Aminosäuren und Sekundärmetaboliten beteiligt sind. Die Eigenschaften der posttranslationalen Modifikation von EF-P wurde in Corynebacterium glutamicum, Streptomyces coelicolor und Mycobacterium tuberculosis untersucht. Die Analyse der Proteinfunktionalität, der molekularen Masse, der Ladung und der Röntgenkristallstruktur führte zu Hinweisen, dass in Actinobakterien EF-P keine posttranslationale Modifikation zur Aktivierung benötigt. Während die Funktion und die gesamte 3D-Struktur dieses EF-P-Typs konserviert ist, wird die β2Ωβ3 Schleife, die das konservierte Lysin32 enthält, von zwei essentiellen Prolinen (P30 und P34) flankiert, die deren Flexibilität einschränken. Aminosäuresubstitutionen, die die Schleife flexibler machen, hemmen die EF-P-Funktion vollständig. Diese neue EF-P-Unterfamilie ist in 11 % aller Bakterien zu finden. Das Genom von C. glutamicum kodiert für 1.468 Polyprolin-Motive, von denen viele in Transkriptionsregulatoren und Kohlenhydrattransportern zu finden sind. Die Notwendigkeit von EF-P für die Translation von Kohlenhydrattransportern kann ein Engpass in der Proteinproduktion sein, der die Leistung industrieller Stämme beeinträchtigt. EIIGlc – die Glukose-spezifische Permease des Phosphoenolpyruvats (PEP): Zucker-Phosphotransferase-System (PTS) – kodiert durch ptsG, ist das wichtigste Glukoseaufnahmesystem von C. glutamicum. Da ein Polyprolin vorhanden ist, ist die Produktion von EIIGlc im efp Deletionsstamm stark reduziert, was zu einer geringeren Glukoseaufnahmerate und einem Wachstumsdefekt führt. Das Polyprolin-Motiv ist für die Funktionalität essentiell und konnte in einer „unbiased random mutagenesis“ nicht durch eine andere Aminosäuresequenz ersetzt werden. GntR2, ein Transkriptionsaktivator von ptsG, ist ebenfalls EF-P-abhängig. Eine reduzierte Kopienzahl von GntR2 kann jedoch durch andere Regulatoren kompensiert werden. Die Analyse der Zelllysate von C. glutamicum und S. coelicolor zeigte, dass die Menge an EF-P in der frühen stationären Phase hochreguliert wird, einem Zeitpunkt, zu dem Actinobakterien bekanntlich große Mengen an Aminosäuren und anderen Sekundärmetaboliten produzieren und sezernieren. Die evolutionäre Analyse von Polyprolin-Motiven im Proteom von S. coelicolor ergab Hinweise auf eine evolutionäre Selektion gegen Arrestmotive im Kernproteom, nicht aber in den Enzymen, die für die Produktion von Sekundärmetaboliten verantwortlich sind. Proteinkomplexe, die für die Antibiotika-Produktion essentiell sind, enthalten bis zu 15 Polyprolin-Motive. In einer efp Deletionsmutante war die Produktion von Coelimycin P1, Undecylprodigiosin und Actinorhodin äußerst stark reduziert. Diese Arbeit liefert Hinweise darauf, dass EF-P ohne posttranslationale Modifikationen in den bekanntesten Actinobacteria aktiv ist. Außerdem bildet EF-P einen Engpass bei der Translation von Kohlenhydrattransportern und Enzymen des Sekundärstoffwechsels.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: EF-P translation, post-translational modification, Corynebacterium glutamicum, Mycobacterium tuberculosis, Streptomyces coelicolor, Glucose uptake, GntR2 phosphotransferase system, ptsG translational control
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
• Fakultäten: Fakultät für Biologie
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 6. Juli 2020
• 1. Bericht­erstatter:in: Jung, Kirsten