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Untersuchung einer diskriminierenden quantitativen reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion zum Nachweis mutierter Coronaviren bei Katzen mit feliner infektiöser Peritonitis
Untersuchung einer diskriminierenden quantitativen reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion zum Nachweis mutierter Coronaviren bei Katzen mit feliner infektiöser Peritonitis
Feline infektiöse Peritonitis (FIP) ist eine weltweit verbreitete Erkrankung der Feliden. Ausgelöst wird die Krankheit durch das feline Coronavirus (FCoV), ein an sich harmloser Durchfallerreger, welcher in der Katze zum tödlichen Virus mutiert. Ort und Anzahl der Mutation(en) sind Gegenstand vieler Studien über FIP. Zwei Mutationen im FCoV-Spike-Gen (S-Gen), die zu den zwei Aminosäuresubstitutionen M1058L (Methionin zu Leucin) und S1060A (Serin zu Alanin) im Spike-Protein führen, wurden als ursächlich für die Entstehung von FIP postuliert. Jedoch wurde die Aminosäuresubstitution M1058L vor kurzem auch in Gewebe von Katzen ohne FIP gefunden, was die Rolle der Mutation als Auslöser für FIP in Frage stellt. Goldstandard der Diagnostik ist weiterhin die Immunhistochemie (IHC) aus dem Gewebe betroffener Tiere. Dies setzt eine invasive Probenentnahme für ein bereits geschwächtes Tier voraus. Um bereits eine Diagnose ante mortem stellen zu können, wurde eine mittlerweile kommerziell erhältliche, quantitative reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) entwickelt, welche anhand der S-Gen-Mutationen zwischen mutiertem und nicht-mutiertem FCoV unterscheiden soll (S-RT-PCR). Ziel der ersten Studie war es, festzustellen, inwiefern die beiden Aminosäuresubstitutionen im Spike-Protein mit dem Auftreten von FIP korrelieren. Mittels diskriminierender RT-qPCR wurde paraffiniertes Gewebe sowohl von Katzen mit FIP als auch von Kontrolltieren zunächst auf das Vorhandensein von FCoV (mittels 7b-RT-PCR) sowie, in einem zweiten Schritt, auf Mutationen im S-Gen (mittels S-RT-PCR) untersucht. Alle Katzen mit FIP wiesen histopathologisch typische Veränderungen auf und waren positiv in der IHC. Alle Kontrolltiere zeigten mindestens einen FIP-typischen klinischen oder labordiagnostischen Parameter. Die histopathologische Untersuchung sowie die IHC ergaben jedoch bei allen Kontrolltieren keinen Hinweis auf FIP. Die Spezifität der S-RT-PCR im Gewebe betrug 100 %. Bei 23/34 Tieren mit FIP wurde die Aminosäuresubstitution M1058L nachgewiesen. Bei einem Tier mit FIP wurde sowohl mutiertes als auch nicht-mutiertes Virus detektiert. Dies resultierte in einer akzeptablen Sensitivität der S-RT-PCR von 70,6 %. Eine Probe einer Katze mit FIP konnte trotz hoher Viruslast nicht genotypisiert werden. Mögliche Ursachen dafür könnten bisher unbekannte Sequenzvariationen im S-Gen oder eine Infektion mit FCoV-Serotyp-II gewesen sein. In der ersten Studie korrelierte damit das Auftreten der Aminosäuresubstitution M1058L mit dem Auftreten von FIP. FCoV wurde in geringer Menge in Gewebe von Kontrolltieren gefunden, aufgrund der niedrigen Viruslast konnte jedoch nicht bestimmt werden, ob es sich um mutiertes oder nichtmutiertes FCoV handelte. Dies bestätigte die Beobachtung vorheriger Studien bezüglich des systemischen Vorkommens von FCoV auch bei Katzen ohne FIP. Ziel der zweiten Studie war die Untersuchung von Kammerwasser auf das Vorhandensein von FCoV-RNA und FCoV-Antigen bei Katzen mit FIP und Kontrolltieren und damit die Evaluation eines potentiellen Nutzens von Kammerwasser in der FIP-Diagnostik. Mittels diskriminierender RT-qPCR (7b- RT-PCR und S-RT-PCR) wurde das Kammerwasser zum einen auf das Vorhandensein von mutiertem und nicht-mutiertem FCoV untersucht, zum anderen wurde bei einem Teil der Tiere eine Immunzytochemie (ICC) zum Nachweis von FCoV-Antigen in Makrophagen durchgeführt. Bei allen Tieren mit FIP wurde die Erkrankung mittels Histologie sowie positiver IHC bestätigt und bei allen Kontrolltieren mittels Histologie und negativer IHC ausgeschlossen. Die Spezifität der 7b-RT-PCR zum Nachweis mutierter und nicht-mutierter FCoV im Kammerwasser betrug 100 %. Da bei keiner Kontrollkatze FCoV im Kammerwasser nachweisbar war, konnte die S-RT-PCR nicht durchgeführt werden und die Spezifität der S-RT-PCR war damit nicht beurteilbar. Die Sensitivität der 7b-RT-PCR betrug 35,5 %, die Sensitivität der S-RT-PCR lag lediglich bei 12,9 %. Eine mögliche Erklärung hierfür wäre das mangelnde Vorliegen an entzündlichen Augenveränderungen, die einen Übertritt von Virus aus den Blutgefäßen in das Kammerwasser begünstigen könnten. Obwohl die 7b-RT-PCR keine falschpositiven Ergebnisse lieferte, eignet sich die Untersuchung von Kammerwasser mittels RT-qPCR daher aufgrund der niedrigen Sensitivität nicht zur Diagnostik von FIP. Verglichen mit den Ergebnissen der 7b- und S-RT-PCR, erzielte die ICC die beste Sensitivität mit 62,5 %. Da zwei Tiere der Kontrollgruppe in der ICC falsch-positiv waren, betrug die Spezifität jedoch lediglich 80,0 %. Die wahrscheinlichste Erklärung für die falsch-positiven Ergebnisse ist das Anfärben von systemisch vorkommendem, wenig pathogenem FCoV oder sogar das Vorliegen einer frühen FIP. Da die Spezifität bei einer tödlich verlaufenden Erkrankung wie FIP der wichtigste diagnostische Parameter ist, ist auch die ICC in Kammerwasser für eine definitive Diagnosestellung nicht geeignet.
FIP, Katzen, Coronavirus, S-RT-PCR, RT-qPCR, 7b-RT-PCR, FCoV-Spike-Gen
Sangl, Laura
2020
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Sangl, Laura (2020): Untersuchung einer diskriminierenden quantitativen reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion zum Nachweis mutierter Coronaviren bei Katzen mit feliner infektiöser Peritonitis. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Feline infektiöse Peritonitis (FIP) ist eine weltweit verbreitete Erkrankung der Feliden. Ausgelöst wird die Krankheit durch das feline Coronavirus (FCoV), ein an sich harmloser Durchfallerreger, welcher in der Katze zum tödlichen Virus mutiert. Ort und Anzahl der Mutation(en) sind Gegenstand vieler Studien über FIP. Zwei Mutationen im FCoV-Spike-Gen (S-Gen), die zu den zwei Aminosäuresubstitutionen M1058L (Methionin zu Leucin) und S1060A (Serin zu Alanin) im Spike-Protein führen, wurden als ursächlich für die Entstehung von FIP postuliert. Jedoch wurde die Aminosäuresubstitution M1058L vor kurzem auch in Gewebe von Katzen ohne FIP gefunden, was die Rolle der Mutation als Auslöser für FIP in Frage stellt. Goldstandard der Diagnostik ist weiterhin die Immunhistochemie (IHC) aus dem Gewebe betroffener Tiere. Dies setzt eine invasive Probenentnahme für ein bereits geschwächtes Tier voraus. Um bereits eine Diagnose ante mortem stellen zu können, wurde eine mittlerweile kommerziell erhältliche, quantitative reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) entwickelt, welche anhand der S-Gen-Mutationen zwischen mutiertem und nicht-mutiertem FCoV unterscheiden soll (S-RT-PCR). Ziel der ersten Studie war es, festzustellen, inwiefern die beiden Aminosäuresubstitutionen im Spike-Protein mit dem Auftreten von FIP korrelieren. Mittels diskriminierender RT-qPCR wurde paraffiniertes Gewebe sowohl von Katzen mit FIP als auch von Kontrolltieren zunächst auf das Vorhandensein von FCoV (mittels 7b-RT-PCR) sowie, in einem zweiten Schritt, auf Mutationen im S-Gen (mittels S-RT-PCR) untersucht. Alle Katzen mit FIP wiesen histopathologisch typische Veränderungen auf und waren positiv in der IHC. Alle Kontrolltiere zeigten mindestens einen FIP-typischen klinischen oder labordiagnostischen Parameter. Die histopathologische Untersuchung sowie die IHC ergaben jedoch bei allen Kontrolltieren keinen Hinweis auf FIP. Die Spezifität der S-RT-PCR im Gewebe betrug 100 %. Bei 23/34 Tieren mit FIP wurde die Aminosäuresubstitution M1058L nachgewiesen. Bei einem Tier mit FIP wurde sowohl mutiertes als auch nicht-mutiertes Virus detektiert. Dies resultierte in einer akzeptablen Sensitivität der S-RT-PCR von 70,6 %. Eine Probe einer Katze mit FIP konnte trotz hoher Viruslast nicht genotypisiert werden. Mögliche Ursachen dafür könnten bisher unbekannte Sequenzvariationen im S-Gen oder eine Infektion mit FCoV-Serotyp-II gewesen sein. In der ersten Studie korrelierte damit das Auftreten der Aminosäuresubstitution M1058L mit dem Auftreten von FIP. FCoV wurde in geringer Menge in Gewebe von Kontrolltieren gefunden, aufgrund der niedrigen Viruslast konnte jedoch nicht bestimmt werden, ob es sich um mutiertes oder nichtmutiertes FCoV handelte. Dies bestätigte die Beobachtung vorheriger Studien bezüglich des systemischen Vorkommens von FCoV auch bei Katzen ohne FIP. Ziel der zweiten Studie war die Untersuchung von Kammerwasser auf das Vorhandensein von FCoV-RNA und FCoV-Antigen bei Katzen mit FIP und Kontrolltieren und damit die Evaluation eines potentiellen Nutzens von Kammerwasser in der FIP-Diagnostik. Mittels diskriminierender RT-qPCR (7b- RT-PCR und S-RT-PCR) wurde das Kammerwasser zum einen auf das Vorhandensein von mutiertem und nicht-mutiertem FCoV untersucht, zum anderen wurde bei einem Teil der Tiere eine Immunzytochemie (ICC) zum Nachweis von FCoV-Antigen in Makrophagen durchgeführt. Bei allen Tieren mit FIP wurde die Erkrankung mittels Histologie sowie positiver IHC bestätigt und bei allen Kontrolltieren mittels Histologie und negativer IHC ausgeschlossen. Die Spezifität der 7b-RT-PCR zum Nachweis mutierter und nicht-mutierter FCoV im Kammerwasser betrug 100 %. Da bei keiner Kontrollkatze FCoV im Kammerwasser nachweisbar war, konnte die S-RT-PCR nicht durchgeführt werden und die Spezifität der S-RT-PCR war damit nicht beurteilbar. Die Sensitivität der 7b-RT-PCR betrug 35,5 %, die Sensitivität der S-RT-PCR lag lediglich bei 12,9 %. Eine mögliche Erklärung hierfür wäre das mangelnde Vorliegen an entzündlichen Augenveränderungen, die einen Übertritt von Virus aus den Blutgefäßen in das Kammerwasser begünstigen könnten. Obwohl die 7b-RT-PCR keine falschpositiven Ergebnisse lieferte, eignet sich die Untersuchung von Kammerwasser mittels RT-qPCR daher aufgrund der niedrigen Sensitivität nicht zur Diagnostik von FIP. Verglichen mit den Ergebnissen der 7b- und S-RT-PCR, erzielte die ICC die beste Sensitivität mit 62,5 %. Da zwei Tiere der Kontrollgruppe in der ICC falsch-positiv waren, betrug die Spezifität jedoch lediglich 80,0 %. Die wahrscheinlichste Erklärung für die falsch-positiven Ergebnisse ist das Anfärben von systemisch vorkommendem, wenig pathogenem FCoV oder sogar das Vorliegen einer frühen FIP. Da die Spezifität bei einer tödlich verlaufenden Erkrankung wie FIP der wichtigste diagnostische Parameter ist, ist auch die ICC in Kammerwasser für eine definitive Diagnosestellung nicht geeignet.