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Functional characterization of bacterial sRNAs involved in stress responses and quorum sensing of bacterial pathogens
Functional characterization of bacterial sRNAs involved in stress responses and quorum sensing of bacterial pathogens
Pathogenic bacteria such as Vibrio cholerae, the causative agent of cholera disease, thrive in host and non-host environments. This lifestyle requires constant monitoring of environmental signals to mediate adaptation through changes in gene expression. Furthermore, V. cholerae employs quorum sensing systems to synchronize group behaviors, such as biofilm formation and virulence gene expression. Both processes frequently involve regulation of gene expression by small regulatory RNAs (sRNAs). Bacterial sRNAs base-pair to trans encoded target mRNAs to alter their stability or translation. Recent studies in V. cholerae identified 107 putative sRNAs with yet undescribed functions. The present work aimed to characterize candidate sRNAs with respect to their involvement in stress responses and quorum sensing. Specifically, a bioinformatical approach aiming to identify binding sites of the envelope stress related, alternative sigma factor σE, identified the MicV sRNA as a member of the σE regulon. The σE stress response of V. cholerae involves regulation by another sRNA, VrrA. Expression of both sRNAs is activated under high cell density conditions or by treatment with membrane damaging agents. Global transcriptome analyses revealed that both sRNAs act together to control outer membrane protein expression, and to maintain envelope homeostasis under membrane damaging conditions. We pinpoint collective functions of both sRNAs to the presence of a conserved base-pairing domain in both sRNAs. Finally, laboratory selection experiments employing a library of synthetic sRNAs revealed that regulation of a single porin is sufficient to mediate stress relief. The third sRNA studied in this thesis, VadR, was identified using a genetic screen to assess sRNAs affecting cell curvature of V. cholerae. Analyses of the vadR promoter revealed that vadR expression is activated in response to cell wall damage by the VxrAB two component system. Transcriptome analyses revealed that VadR regulates a large gene cluster responsible for synthesis of the biofilm matrix, and biofilm formation was inhibited in cells overexpressing vadR. Additionally, we found that VadR regulates cell curvature by inhibiting translation of crvA, encoding the major curvature determinant of V. cholerae. Finally, we pinpoint regulation of crvA by VadR to be critical to mediate resistance to cell wall damage. Expression of the fourth sRNA analyzed in this study, VqmR, is controlled by quorum sensing system, involving the autoinducer DPO. Analyses aiming to identify additional mRNA targets for the VqmR sRNA found five additional targets, including the low cell density master regulator aphA. VqmR base-pairs to aphA using an unusual site located in the rho-independent terminator of the sRNA. Regulation of aphA by VqmR resulted in reduced virulence gene expression. Finally, the present work found that the interplay of all three quorum sensing systems is required to achieve a full quorum sensing response., Bakterielle Pathogene wie Vibrio cholerae, der Erreger der Cholera, finden sich in der Umwelt und in Wirtsorganismen. Dieser Lebenszyklus setzt ein konstantes Überwachen von Umweltsignalen voraus, um sich durch entsprechende Genexpression anzupassen. Zudem verwendet V. cholerae bakterielle Kommunikationssysteme um Gruppenverhalten, wie das Bilden von Biofilmen und die Expression von Virulenzgenen, in der Population zu synchronisieren. Diese beiden Prozesse beinhalten häufig die Regulation der Genexpression durch kleine regulatorische RNAs (sRNAs). Bakterielle sRNAs interagieren über Basen-paarungen mit trans-kodierten mRNAs, um deren Stabilität oder Translation zu regulieren. Jüngste Studien haben 107 potenzielle sRNAs, mit bisher ungeklärten Funktionen, in V. cholerae identifiziert. Ziel der vorliegenden Arbeit war es diese sRNAs, unter Berücksichtigung ihrer Beteiligung an Stressantworten und bakterieller Kommunikation, zu charakterisieren. Im Einzelnen wurde ein bioinformatischer Ansatz verwendet, um die Bindestellen des Membranstress-Sigmafaktors σE zu finden und dabei wurde die sRNA MicV als Teil des σE-Regulons identifiziert. Die σE Stressantwort in V. cholerae beinhaltet Regulation durch eine weitere sRNA, VrrA. Die Expression beider sRNAs wird bei hohen Zelldichten, oder durch Behandlung mit membranschädigenden Substanzen, aktiviert. Transkriptomanalysen zeigten das beide sRNAs gemeinsam die Expression von Proteinen der äußeren Membran regulieren, um die Membranhomeostase unter Membranstressbedingungen zu gewährleisten. Die überlappenden Funktionen beider sRNAs begründen sich durch das Vorhandensein einer konservierten Domäne zur Basenpaarung. Abschließend zeigten wir durch Selektionsexperimente mit einer Sammlung von synthetischen sRNAs, dass die Regulation eines einzigen Porins ausreicht, um Membranstress zu lindern. Die dritte sRNA in dieser Studie, VadR, wurde durch einen genetischen Screen für sRNAs die die Zellkrümmung von V. cholerae beeinflussen gefunden. Analysen des vadR Promotors zeigten das die Expression von vadR bei Zellwandstress durch das VxrAB Zwei-komponentensystem aktiviert wird. Transkriptomanalysen zeigten das VadR ein großes Gencluster, verantwortlich für die Synthese der Biofilm Matrix, reguliert. Demzufolge war die Bildung von Biofilmen in Zellen die vadR überexprimieren inhibiert. Zusätzlich regulierte VadR durch Inhibieren der Translation der crvA mRNA, welche für eine wichtige Zellkrümmungs-determinante kodiert, die Zellkrümmung. Letztendlich zeigten wir das die Regulation von crvA durch VadR entscheidend für die Resistenz gegen Zellwandstress ist. Die Expression der vierten sRNA in dieser Studie, VqmR, wird durch ein bakterielles Kommunikationssystem und den Autoinducer DPO reguliert. Durch Analysen, die darauf abzielten neue Ziel-mRNAs der VqmR sRNA zu identifizieren, konnten fünf weitere Ziel-mRNAs identifiziert werden, welche unter anderem, für den Hauptregulator bei niedriger Zelldichte, AphA, kodieren. Die Basenpaarung zwischen VqmR und aphA ist ungewöhnlich, und benötigte eine Region im Rho-unabhängigen Terminator der sRNA. Die Regulation von aphA durch VqmR resultierte in einer Reduktion der Virulenzgenexpression. Schlussendlich konnte die vorliegende Arbeit zudem zeigen das drei bakterielle Kommunikationssysteme zusammenwirken, um ihre volle Wirkung zu entfalten.
Vibrio cholerae, small RNAs, stress responses, quorum sensing
Peschek, Nikolai
2020
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Peschek, Nikolai (2020): Functional characterization of bacterial sRNAs involved in stress responses and quorum sensing of bacterial pathogens. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Pathogenic bacteria such as Vibrio cholerae, the causative agent of cholera disease, thrive in host and non-host environments. This lifestyle requires constant monitoring of environmental signals to mediate adaptation through changes in gene expression. Furthermore, V. cholerae employs quorum sensing systems to synchronize group behaviors, such as biofilm formation and virulence gene expression. Both processes frequently involve regulation of gene expression by small regulatory RNAs (sRNAs). Bacterial sRNAs base-pair to trans encoded target mRNAs to alter their stability or translation. Recent studies in V. cholerae identified 107 putative sRNAs with yet undescribed functions. The present work aimed to characterize candidate sRNAs with respect to their involvement in stress responses and quorum sensing. Specifically, a bioinformatical approach aiming to identify binding sites of the envelope stress related, alternative sigma factor σE, identified the MicV sRNA as a member of the σE regulon. The σE stress response of V. cholerae involves regulation by another sRNA, VrrA. Expression of both sRNAs is activated under high cell density conditions or by treatment with membrane damaging agents. Global transcriptome analyses revealed that both sRNAs act together to control outer membrane protein expression, and to maintain envelope homeostasis under membrane damaging conditions. We pinpoint collective functions of both sRNAs to the presence of a conserved base-pairing domain in both sRNAs. Finally, laboratory selection experiments employing a library of synthetic sRNAs revealed that regulation of a single porin is sufficient to mediate stress relief. The third sRNA studied in this thesis, VadR, was identified using a genetic screen to assess sRNAs affecting cell curvature of V. cholerae. Analyses of the vadR promoter revealed that vadR expression is activated in response to cell wall damage by the VxrAB two component system. Transcriptome analyses revealed that VadR regulates a large gene cluster responsible for synthesis of the biofilm matrix, and biofilm formation was inhibited in cells overexpressing vadR. Additionally, we found that VadR regulates cell curvature by inhibiting translation of crvA, encoding the major curvature determinant of V. cholerae. Finally, we pinpoint regulation of crvA by VadR to be critical to mediate resistance to cell wall damage. Expression of the fourth sRNA analyzed in this study, VqmR, is controlled by quorum sensing system, involving the autoinducer DPO. Analyses aiming to identify additional mRNA targets for the VqmR sRNA found five additional targets, including the low cell density master regulator aphA. VqmR base-pairs to aphA using an unusual site located in the rho-independent terminator of the sRNA. Regulation of aphA by VqmR resulted in reduced virulence gene expression. Finally, the present work found that the interplay of all three quorum sensing systems is required to achieve a full quorum sensing response.

Abstract

Bakterielle Pathogene wie Vibrio cholerae, der Erreger der Cholera, finden sich in der Umwelt und in Wirtsorganismen. Dieser Lebenszyklus setzt ein konstantes Überwachen von Umweltsignalen voraus, um sich durch entsprechende Genexpression anzupassen. Zudem verwendet V. cholerae bakterielle Kommunikationssysteme um Gruppenverhalten, wie das Bilden von Biofilmen und die Expression von Virulenzgenen, in der Population zu synchronisieren. Diese beiden Prozesse beinhalten häufig die Regulation der Genexpression durch kleine regulatorische RNAs (sRNAs). Bakterielle sRNAs interagieren über Basen-paarungen mit trans-kodierten mRNAs, um deren Stabilität oder Translation zu regulieren. Jüngste Studien haben 107 potenzielle sRNAs, mit bisher ungeklärten Funktionen, in V. cholerae identifiziert. Ziel der vorliegenden Arbeit war es diese sRNAs, unter Berücksichtigung ihrer Beteiligung an Stressantworten und bakterieller Kommunikation, zu charakterisieren. Im Einzelnen wurde ein bioinformatischer Ansatz verwendet, um die Bindestellen des Membranstress-Sigmafaktors σE zu finden und dabei wurde die sRNA MicV als Teil des σE-Regulons identifiziert. Die σE Stressantwort in V. cholerae beinhaltet Regulation durch eine weitere sRNA, VrrA. Die Expression beider sRNAs wird bei hohen Zelldichten, oder durch Behandlung mit membranschädigenden Substanzen, aktiviert. Transkriptomanalysen zeigten das beide sRNAs gemeinsam die Expression von Proteinen der äußeren Membran regulieren, um die Membranhomeostase unter Membranstressbedingungen zu gewährleisten. Die überlappenden Funktionen beider sRNAs begründen sich durch das Vorhandensein einer konservierten Domäne zur Basenpaarung. Abschließend zeigten wir durch Selektionsexperimente mit einer Sammlung von synthetischen sRNAs, dass die Regulation eines einzigen Porins ausreicht, um Membranstress zu lindern. Die dritte sRNA in dieser Studie, VadR, wurde durch einen genetischen Screen für sRNAs die die Zellkrümmung von V. cholerae beeinflussen gefunden. Analysen des vadR Promotors zeigten das die Expression von vadR bei Zellwandstress durch das VxrAB Zwei-komponentensystem aktiviert wird. Transkriptomanalysen zeigten das VadR ein großes Gencluster, verantwortlich für die Synthese der Biofilm Matrix, reguliert. Demzufolge war die Bildung von Biofilmen in Zellen die vadR überexprimieren inhibiert. Zusätzlich regulierte VadR durch Inhibieren der Translation der crvA mRNA, welche für eine wichtige Zellkrümmungs-determinante kodiert, die Zellkrümmung. Letztendlich zeigten wir das die Regulation von crvA durch VadR entscheidend für die Resistenz gegen Zellwandstress ist. Die Expression der vierten sRNA in dieser Studie, VqmR, wird durch ein bakterielles Kommunikationssystem und den Autoinducer DPO reguliert. Durch Analysen, die darauf abzielten neue Ziel-mRNAs der VqmR sRNA zu identifizieren, konnten fünf weitere Ziel-mRNAs identifiziert werden, welche unter anderem, für den Hauptregulator bei niedriger Zelldichte, AphA, kodieren. Die Basenpaarung zwischen VqmR und aphA ist ungewöhnlich, und benötigte eine Region im Rho-unabhängigen Terminator der sRNA. Die Regulation von aphA durch VqmR resultierte in einer Reduktion der Virulenzgenexpression. Schlussendlich konnte die vorliegende Arbeit zudem zeigen das drei bakterielle Kommunikationssysteme zusammenwirken, um ihre volle Wirkung zu entfalten.