Identification and characterization of novel methyltransferases

Ignatova, Valentina (2020): Identification and characterization of novel methyltransferases. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie

Abstract

So far 172 different types of nucleic acid modifications had been identified. However, for many RNA and DNA modifications the function(s) and the modifying enzymes (”writers”) are still not known. In my Ph.D. project, I focused on the identification of novel RNA and DNA methyltransferases. To identify novel enzymes, I systematically screened a collection of potential methyltransferases on the range of substrates in in vitro methyltransferase assay. I found four enzymes that exhibit robust methyltransferases activity towards RNA. Size exclusion chromatography in combination with labelling approaches and mass spectrometry allowed me to narrow down potential substrates and to identify the modified nucleosides for two candidate enzymes. I characterized METTL6 as a tRNA methyltransferases that specifically catalyzes methylation of cytosines at position 3 (m3C). By performing methyltransferase assays as well as sequence-specific purification of individual tRNAs, I identified the specific tRNA isoacceptors that are METTL6 targets and the precise position of the methylated C. RNA-seq and Ribosome profiling of KO mES cell lines revealed global changes in the transcriptome and translatome. In line with these changes, Mettl6 KO cells showed slower proliferation rates. Interestingly, METTL6 depletion resulted in slower hepatocellular tumor growth in in vitro models. In agreement with this, patients with high METTL6 expression levels have a reduced survival rate. I identified, METTL5 as a novel m6A RNA methyltransferase. Mass spectrometry analysis of RNA from Mettl5 KO mES cells revealed a decrease in m6A levels in 18S rRNA. By performing m6A-immunopreciptaion followed by sequencing in wt and Mettl5 KO cells, I mapped the transcript wide distribution of m6A in non-ribosomal RNAs. In addition to this, Mettl5 KO mES cells are less pluripotent and compromised in their ability to differentiate into neuronal precursors cells. In a complementary approach, I wanted to identify the interactome of METTL proteins. For this, I generated stable cells lines expressing tagged METTL family members, purified the complexes, and analysed interaction partners by mass spectrometry. The systematic identification of the complexes in which these potential enzymes act provides a useful resource for the epitranscriptomics community as it helps to understand METTL proteins function(s) and substrate specificities. Overall, in my Ph.D. project, I profiled the enzymatic activities and the interactome of 13 proteins of the METTL family. For two novel RNA methyltransferases, I characterized the substrates and the type of methylation they catalyse, profiled changes in the transcriptome and translatome, and characterized the phenotypes of mES cells upon KO of these two enzymes.

Abstract

Bisher wurden 172 verschiedene Arten von Nukleinsäuremodifikationen identifiziert. Für viele dieser RNA- und DNA-Modifikationen sind die Funktion (en) und die modifizierenden Enzyme ("Writer") jedoch noch nicht bekannt. In meinem Promotionsprojekt beschäftigte ich mich mit der Identifizierung neuartiger RNA- und DNA- Methyltransferasen. Um neue Enzyme zu identifizieren, habe ich systematisch eine Sammlung potenzieller Methyltransferasen in in-vitro-Methyltransferase-Assays auf verschiedenen Substraten untersucht. Ich habe vier Enzyme identifiziert, die robuste Methyltransferaseaktivität gegenüber RNA aufweisen. Größenausschlusschromatographie in Kombination mit Markierungsansätzen und Massenspektrometrie ermöglichten es mir, potenzielle Substrate einzugrenzen und die modifizierten Nukleoside für zwei positive Kandidaten zu identifizieren. Ich charakterisierte METTL6 als tRNA-Methyltransferase, die spezifisch m3C katalysiert. Durch Methyltransferase-Assays sowie sequenzspezifische Aufreinigung einzelner tRNAs identifizierte ich spezifische tRNA-Isoakzeptoren als METTL6-Tagets und die genaue Position des methylierten Cytosins. RNA-seq- und Ribosomen-Profiling von KO-mES-Zelllinien ergab globale Veränderungen im Transkriptom und Translatom. In Übereinstimmung mit diesen Änderungen zeigten Mettl6-KO-Zellen geringere Proliferationsraten. Interessanterweise führte METTL6-Depletion in in vitro-Modellen zu einem langsameren Wachstum hepatozellulärer Tumore. In Übereinstimmung damit haben Patienten mit hoher METTL6 Exoression eine verringerte Überlebensrate. Ich identifizierte METTL5 als eine neue m6A-RNA-Methyltransferase. Die massenspektrometrische Analyse von RNA aus Mettl5 KO mES-Zellen ergab eine Abnahme der Menge an m6A in 18S-rRNA. Durch das Durchführen von m6A- Immunpräzipationen, gefolgt von Sequenzierung in wt- und Mettl5 KO-Zellen, kartierte ich die transkriptweite Verteilung von m6A in nicht-ribosomalen RNAs. Diese METTL5-KO mES-Zellen verlieren Pluripotency und ihre Fähigkeit sich korrekt in neuronale Vorläuferzellen zu differenzieren. In einem komplementären Ansatz wollte ich das „Interaktom“ von METTL-Proteinen identifizieren. Zu diesem Zweck erzeugte ich stabile Zelllinien, die getagte METTL Protein exprimieren, reinigte die Komplexe und analysierte die Interaktionspartner durch Massenspektrometrie. Die systematische Identifizierung von Komplexen, in denen diese potenziellen Enzyme wirken, ist eine nützliche Ressource für das Epitranscriptomics Field, da sie zum Verständnis der Funktionen und Substratspezifitäten von METTL-Proteinen beitragen kann. Insgesamt habe ich in meiner Doktorarbeit die enzymatische Aktivität und das Interaktom von 13 Proteinen der METTL-Familie analysiert. Für zwei neue RNA- Methyltransferasen charakterisierte ich die Substrate und die Art der Methylierung, die sie katalysieren, profilierte Veränderungen im Transkriptom und Translatom und identifizierte die Phänotypen von mES-Zellen auf KO dieser beiden Enzyme.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: methyltransferase, m6A, m3C
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
• Fakultäten: Fakultät für Biologie
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 30. April 2020
• 1. Bericht­erstatter:in: Schneider, Robert