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Chemische Synthese und Evaluierung von 2'3'-cGAMP-Analoga
Chemische Synthese und Evaluierung von 2'3'-cGAMP-Analoga
Der second messenger 2‘3‘-cGAMP besteht aus einer außergewöhnlich verknüpften Adenosin- und Guanosinmonophosphat Einheit. Eine nicht-kanonische 2’-5’- und eine kanonische 3‘-5‘-Phosphodiesterbindung bilden den 13-gliedrigen Makrozyklus. Innerhalb der Zelle nimmt dieses zyklische Dinukleotid eine entscheidende Schlüsselfunktion ein, um die angeborene Immunantwort über die cGAS-STING-Achse zu steuern. Diese Signalkaskade wird durch das Auftreten von doppelsträngiger DNA im Zytosol ausgelöst, z.B. während Infektionen oder Zell-Gleichgewichtsstörungen. Dem Immunotransmitter 2‘3‘-cGAMP wird ein immenses therapeutisches Potenzial attestiert, um die cGAS-STING-Achse in Immunzellen zu modulieren. Denn es besteht die Hoffnung, dass degenerierte Zellen eines Organismus selektiv und schonend aussortiert werden können (z.B. bei Krebszellen) – anders als bei Chemotherapien, die mit starken Nebenwirkungen verbunden sind. Die pharmakokinetischen Eigenschaften von 2‘3‘-cGAMP sind allerdings nicht ausreichend, um die Anforderungen eines potenten Arzneimittels zu erfüllen. Grund dafür ist unter anderem die Natur der zwei negativ geladenen Phosphodiesterbindungen und der damit einhergehenden schlechten Penetration der Zellmembran. In der vorliegenden Dissertation wurde ein neutral geladenes 2‘3‘-cGAMP-Analogon über 20 Stufen im 100 mg-Maßstab synthetisiert mit mutmaßlich verbesserter Membranpermeation. Der Zyklus wurde durch einen Triazol- und Amid-Linker verbrückt. Dadurch wurde ein synthetischer Zugang zu neutralen Nukleosid-Cyclophanen geschaffen. Eine Ligandenbindung mit STING konnte nicht detektiert werden und die inhibitorischen Effekte auf cGAS besaßen in vitro Optimierungsbedarf. In einem weiteren Ansatz wurde ein fluoreszierendes Analogon mit einer modifizierten Thiophen-Nukleobase in 11 Stufen konstruiert. Dieses sollte das Studium der STING-Mikroumgebung in Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität, neue Ligandenverdrängungsassays oder bildgebende Mikroskopieverfahren ermöglichen. Während das sogenannte 2‘3‘-TorGAMP an murines STING eine nanomolare Bindung zeigte, erforderten die Bindungsinteraktionen mit humanem STING noch strukturelle Weiterentwicklungen (mikromolare Bindung). Mit den unten dargestellten cGAMP-Analoga konnten die sensiblen STING-Interaktionen untersucht werden., The second messenger 2‘3‘-cGAMP consists of an unusually connected adenosine and guanosine monophosphate unit. The 13-membered macrocylce is composed of a non-canonical 2‘-5‘ and a canonical 3‘-5‘ phosphodiester bond. Within the cell, this cyclic dinucleotide holds key functions by controlling the innate immune response via the cGAS-STING axis. During infections or disruptions of the cell’s homeostasis the cGAS-STING signaling cascade is triggered by the occurrence of double stranded DNA in the cytosol. It is believed that the immunotransmitter 2’3’-cGAMP possesses remarkable therapeutic potentials because it is able to tune the cGAS-STING pathway in immune cells. On account of this, there is hope to eliminate degenerated cells under selective and mild conditions (e.g. cancer cells) – in contrast to chemotherapies which feature severe side effects. The pharmakokinetic properties of 2‘3‘-cGAMP, however, are not sufficient to meet the requirements of a potent and modern drug. One of the reasons are the two negatively charged phosphodiester bridges and their resulting poor penetrability of the cell membrane. Here, a neutrally charged 2’3’-cGAMP analogue was synthesized on a 100 mg scale over 20 steps with potentially better membrane crossing characteristics. The cycle was linked by a triazol- and amide connection which now provides synthetic access to neutral nucleoside cyclophanes. Further studies of the binding affinity to STING revealed no detectable binding of the ligand. The potential inhibitory effects towards cGAS in vitro require optimization. A second part of this thesis was devoted to the 11-step-synthesis of a fluorescent 2’3’-cGAMP analogue containing a modified thiophen nucleobase. The fluorescent molecule was prepared in order to probe the STING microenvironment and for the development of a new ligand competition assay with the help of new cell imaging methods. While the so-called 2‘3‘-TorGAMP bound to murine STING in nanomolar affinity, the binding interactions with human STING still required structural modifications (micromolar binding). With these two cGAMP analogues in hand, the sensitive STING binding modes could be examined.
cGAMP
Dialer, Clemens Reto
2020
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Dialer, Clemens Reto (2020): Chemische Synthese und Evaluierung von 2'3'-cGAMP-Analoga. Dissertation, LMU München: Faculty of Chemistry and Pharmacy
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Abstract

Der second messenger 2‘3‘-cGAMP besteht aus einer außergewöhnlich verknüpften Adenosin- und Guanosinmonophosphat Einheit. Eine nicht-kanonische 2’-5’- und eine kanonische 3‘-5‘-Phosphodiesterbindung bilden den 13-gliedrigen Makrozyklus. Innerhalb der Zelle nimmt dieses zyklische Dinukleotid eine entscheidende Schlüsselfunktion ein, um die angeborene Immunantwort über die cGAS-STING-Achse zu steuern. Diese Signalkaskade wird durch das Auftreten von doppelsträngiger DNA im Zytosol ausgelöst, z.B. während Infektionen oder Zell-Gleichgewichtsstörungen. Dem Immunotransmitter 2‘3‘-cGAMP wird ein immenses therapeutisches Potenzial attestiert, um die cGAS-STING-Achse in Immunzellen zu modulieren. Denn es besteht die Hoffnung, dass degenerierte Zellen eines Organismus selektiv und schonend aussortiert werden können (z.B. bei Krebszellen) – anders als bei Chemotherapien, die mit starken Nebenwirkungen verbunden sind. Die pharmakokinetischen Eigenschaften von 2‘3‘-cGAMP sind allerdings nicht ausreichend, um die Anforderungen eines potenten Arzneimittels zu erfüllen. Grund dafür ist unter anderem die Natur der zwei negativ geladenen Phosphodiesterbindungen und der damit einhergehenden schlechten Penetration der Zellmembran. In der vorliegenden Dissertation wurde ein neutral geladenes 2‘3‘-cGAMP-Analogon über 20 Stufen im 100 mg-Maßstab synthetisiert mit mutmaßlich verbesserter Membranpermeation. Der Zyklus wurde durch einen Triazol- und Amid-Linker verbrückt. Dadurch wurde ein synthetischer Zugang zu neutralen Nukleosid-Cyclophanen geschaffen. Eine Ligandenbindung mit STING konnte nicht detektiert werden und die inhibitorischen Effekte auf cGAS besaßen in vitro Optimierungsbedarf. In einem weiteren Ansatz wurde ein fluoreszierendes Analogon mit einer modifizierten Thiophen-Nukleobase in 11 Stufen konstruiert. Dieses sollte das Studium der STING-Mikroumgebung in Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität, neue Ligandenverdrängungsassays oder bildgebende Mikroskopieverfahren ermöglichen. Während das sogenannte 2‘3‘-TorGAMP an murines STING eine nanomolare Bindung zeigte, erforderten die Bindungsinteraktionen mit humanem STING noch strukturelle Weiterentwicklungen (mikromolare Bindung). Mit den unten dargestellten cGAMP-Analoga konnten die sensiblen STING-Interaktionen untersucht werden.

Abstract

The second messenger 2‘3‘-cGAMP consists of an unusually connected adenosine and guanosine monophosphate unit. The 13-membered macrocylce is composed of a non-canonical 2‘-5‘ and a canonical 3‘-5‘ phosphodiester bond. Within the cell, this cyclic dinucleotide holds key functions by controlling the innate immune response via the cGAS-STING axis. During infections or disruptions of the cell’s homeostasis the cGAS-STING signaling cascade is triggered by the occurrence of double stranded DNA in the cytosol. It is believed that the immunotransmitter 2’3’-cGAMP possesses remarkable therapeutic potentials because it is able to tune the cGAS-STING pathway in immune cells. On account of this, there is hope to eliminate degenerated cells under selective and mild conditions (e.g. cancer cells) – in contrast to chemotherapies which feature severe side effects. The pharmakokinetic properties of 2‘3‘-cGAMP, however, are not sufficient to meet the requirements of a potent and modern drug. One of the reasons are the two negatively charged phosphodiester bridges and their resulting poor penetrability of the cell membrane. Here, a neutrally charged 2’3’-cGAMP analogue was synthesized on a 100 mg scale over 20 steps with potentially better membrane crossing characteristics. The cycle was linked by a triazol- and amide connection which now provides synthetic access to neutral nucleoside cyclophanes. Further studies of the binding affinity to STING revealed no detectable binding of the ligand. The potential inhibitory effects towards cGAS in vitro require optimization. A second part of this thesis was devoted to the 11-step-synthesis of a fluorescent 2’3’-cGAMP analogue containing a modified thiophen nucleobase. The fluorescent molecule was prepared in order to probe the STING microenvironment and for the development of a new ligand competition assay with the help of new cell imaging methods. While the so-called 2‘3‘-TorGAMP bound to murine STING in nanomolar affinity, the binding interactions with human STING still required structural modifications (micromolar binding). With these two cGAMP analogues in hand, the sensitive STING binding modes could be examined.