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Studie zu seltenen RNA-Modifikationen
Studie zu seltenen RNA-Modifikationen
Die Riboukleinsäure (RNA) basiert auf vier kanonischen Nukleinsäuren. Diese vier Nukleinbasen können in der Zelle enzymatisch weiter funktionalisiert werden. Bereits 1957 wurde die erste RNA-Modifikation, welche heute als Pseudouridin bekannt ist, entdeckt. Heute sind 163 Modifikationen in die Datenbank Modomics eingetragen. Neben der stetig wachsenden Anzahl an bekannten RNA-Modifikationen, wissen wir heute auch, dass diese nicht statisch sind, sondern einige von ihnen dynamischen Regulationsprozessen der Zelle unterliegen. Eine dieser dynamisch regulierten RNA-Modifikationen ist das m6A. Die Methylgruppe am N6 des N6-Methyladenosins kann durch die Eraser-Enzyme FTO und ALKBH5 oxidativ entfernt werden. Neben m6A kann FTO aber auch die Methylgruppe an Modifikationen wie dem m6Am, m1A entfernen. Bei ALKBH5 hingegen sind über das m6A hinaus, keine weiteren Substrate bekannt. In dieser Arbeit wurde gezeigt das ALKBH566-292 neben m6A auch die ribosomale Modifikation N6,N6-Dimethyladenosin (m62A) vollständig demethylieren kann. 2-Methylthioadenosin (ms2A) ist eine RNA-Modifikation, welche anders als m6A, bisher nicht ausgiebig studiert wurde. Die Literatur lässt darauf schließen, dass die Verbindung in tRNAs vorkommt. In dem Organismus Escherichia coli (E.coli), ist neben ms2A mit dem 2-Methylthio-N6-isopentenyladenosine (ms2i6A), nur eine weitere tRNA-Modifikation bekannt, welche an der C2-Position thiomethyliert ist. Das ms2i6A wird durch die Thiomethyltransferase MiaB dargestellt und unterscheidet sich von ms2A durch eine Prenylgruppe an dem exozyklischen Stickstoff an Position sechs. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob das ms2A das Produkt einer enzymatischen Entfernung dieser Prenylgruppe ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass dies wahrscheinlich der Fall ist (Abb. 0.2). Das Enzym, welches die Prenylgruppe des ms2i6A entfernen kann, wurde in dieser Arbeit nicht gefunden. Allerdings konnte die Liste infrage kommender Genprodukte, durch die Untersuchung von E.coli Knockoutstämmen, auf unter 99 reduziert werden. Queuosin ist eine lang bekannte und gut studierte tRNA-Modifikation. Interessanterweise kann sie ausschließlich von Prokaryoten dargestellt werden, kommt aber auch in Eukaryoten vor. In letzteren kann das Queuosin der Tyrosin- und Asparaginsäure-tRNA weiter zu β-Galaktosyl- bzw. β-Mannosylqueuosin derivatisiert werden. Die Strukturen beider Derivate wurde 1976 veröffentlicht, jedoch wurde die Struktur des β-Mannosylqueuosins von Thumbs falsifiziert. In der hier vorliegenden Arbeit konnte in Zellexperimenten, über Mannose-13C6 gezeigt werden, dass es sich bei dem Queuosinderivat in der tRNAAsp tatsächlich um Mannosylqueuosin handelt. Infolgedessen wurden Koinjektionsversuche durchgeführt, bei denen verschiedene synthetische Mannosylqueuosinstandards zusammen mit Gesamt-RNA aus Maus auf ein Massenspektrometer injiziert wurden. Die Versuchsreihen waren zum Zeitpunkt dieser Arbeit nicht vollständig abgeschlossen. Die in dieser Arbeit vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass es sich bei dem Mannosylqueuosin in der tRNAAsp wahrscheinlich um α-Homo-allyl-mannosylqueuosin handelt. Während die de novo Synthese von Queuosin und seinen Derivaten in Prokaryoten vollständig aufgeklärt ist, ist dies in Eukaryoten nicht der Fall. So ist das Enzym, welches α-Mannosylqueuosin darstellt, nicht bekannt. In einer Veröffentlichung von 1976 wurde von einer enzymatischen Aktivität in Rattenleberextrakt berichtet, welche spezifisch das Queuosin der E.coli tRNAAsp mannosylieren kann. In der hier vorliegenden Arbeit wurde ein Experiment auf der Grundlage dieser Veröffentlichung durchgeführt. Jedoch konnte die enzymatische Aktivität in diesen Experimenten nicht beobachtet werden. In dieser Arbeit wurden die Queuosin-, Mannosylqueuosin- und Galaktosylqueuosin-Level zum ersten Mal in sechs verschiedenen Mäuseorganen zu zwei verschiedenen Alterszeitpunkten quantifiziert. Die Alterszeitpunkte sind ein Tag nach der Geburt und drei Monate und fünf Tage nach der Geburt. Hier hat sich gezeigt, dass die Level des Mannosyl- und Galaktosylqueuosins sich mit dem Alter moderater verändern als die des Queuosins. Dieser stärkere Anstieg des Queuosins scheint dabei mit dem Anteil an mitochondrialer tRNA zusammenzuhängen. In Mitochondrien wird das Queuosin, anders als im Zytosol, nicht weiter derivatisiert. Bei allen drei Modifikationen hat sich allerdings gezeigt, dass der Unterschied zwischen Organen größer ist als die Veränderung über das Alter hinweg. So sind die Level in Groß-, Kleinhirn und Herz in der Tendenz höher als in der Niere, Leber und Milz. Die Literatur zeigt, dass die letzten drei Organe eine höhere Proteinsyntheserate haben. Daraus ergibt sich die Vermutung, dass die Q-tRNAs in diesen Organen untermodifziert sind. Der Modifikationsgrad dieser tRNAs scheint mit einer höheren Proteinsyntheserate tendenziell abzunehmen., Ribonucleic acid (RNA) is based on the four canonical nucleic acids. In the cell, those four nucleic acids can be further functionalised. The first modification was already discovered in 1957 and is today known as pseudouridin. Currently there are 163 modifications registered in the Modomics database. Beside the steadily rising number of known RNA-modifications, we today now that some of them are not static, but that some of them are affected by dynamic regulatory processes of the cell. One of these dynamically regulated RNA-modifications is m6A. The methyl group, located at the N6, of the N6- methyladenosine can be removed in an oxidative process by the Eraser-enzymes FTO and ALKBH5. Beside m6A, FTO is also able to remove the methyl group of modifications such as m6Am, m1A. Apart from m6A there are no known other substrates for ALKBH5. This work presents data showing, that ALKBH566-292 is able, to fully demethylate the ribosomal modification N6,N6-dimethyladenosine (m62A). 2-Methylthioadenosine (ms2A) is a RNA-modification that, unlike m6A, is not well studied. Literature suggests, that it is present in tRNAs. In the organism Escherichia coli (E.coli), there is beside 2-methylthio-N6-isopentenyl-adenosine (ms2i6A), only ms2i6A, which is thiomethylated at the C2 position. ms2i6A is synthesized by the thiomethyltransferase MiaB. In contrast to ms2A, it is modified with a prenyl group at the nitrogen at position six. In this thesis it was studied, if ms2A is the product of an enzymatic removal of the prenyl group. The results indicate that this is probably the case (Fig. 0.1). The enzyme responsible for the removal of ms2i6A’s prenyl group, was not identified, but the number of candidates was reduced to less than 99 gene products by studying E.coli knockout strains. Queuosine is a long known and well-studied tRNA modification. Interestingly it can only be synthesized by procaryotes but it is also found in eucaryotes. In the latter case, the queuosine of the tyrosine and aspartic acid tRNA can be further modified to β-galactosyl- and β-mannosyl-queuosine, respectively. The structure of the derivates was published in 1976, but the structure of β-mannosyl-queuosine, was falsified by Thumbs. In this thesis, experiments with mannose-13C6 in cells show, that the queuosine in tRNAAsp is indeed mannosyl-queuosine. Furthermore, a series of experiments where conducted with different synthetic mannosyl-queuosin standards, which where coinjected with total RNA isolated from mice. The series of experiments is currently not complete for a final conclusion. The results of the already conducted experiments indicate that there is probability, that the mannsyl-queuosine of the tRNAAsp is α-homo-allyl-mannosyl-queuosine. While the de novo synthesis of queuosine and its derivates is thourougly studied in procaryotes, that is not the case for eucaryotes. The enzyme which synthesizes α-mannosylqueuosine is not known. A publication from 1976 reported an enzymatic activity in rat liver extract, which specifically mannosylated queuosine in E.coli tRNAAsp. In this thesis I conducted experiments based upon this publication. The reported actvity, however was not observed. I therefore continued to invesitgate the modification levels of queuosine, mannosyl- and galactosyl-queuosine quantitatively in mice at to different ages and in six different organs. The age points were one day after birth and three months and five days after birth. The obtained data show, that mannosyl- and galactosyl-queuosine levels change less with age than queuosine. This strong change of queuosine seems to be correlating with the amount of mitochondrial tRNA. In mitochondria, different to the cytosol, queuosine is not further derivatised. All the modifications levels do differ more across organs than over time. The levels are generally higher in the cerebrum, cerebellum and heart than in the kidney, liver and spleen. According to literature the latter three organs have a higher fractional protein synthesis rate. It seems likely that the Q-tRNAs in these organs are undermodified. Lower levels of modification might be correlating with a higher fractional protein synthesis rate.
2-Methylthioadenosine, ms2A, m62A, dimethyladenosine, m6A, methyladenosine, queuosine, mannosyl-queuosine, galactosyl-queuosine ALKBH5, RNA demethylase ALKBH5
Ensfelder, Timm Taylan
2020
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Ensfelder, Timm Taylan (2020): Studie zu seltenen RNA-Modifikationen. Dissertation, LMU München: Faculty of Chemistry and Pharmacy
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Abstract

Die Riboukleinsäure (RNA) basiert auf vier kanonischen Nukleinsäuren. Diese vier Nukleinbasen können in der Zelle enzymatisch weiter funktionalisiert werden. Bereits 1957 wurde die erste RNA-Modifikation, welche heute als Pseudouridin bekannt ist, entdeckt. Heute sind 163 Modifikationen in die Datenbank Modomics eingetragen. Neben der stetig wachsenden Anzahl an bekannten RNA-Modifikationen, wissen wir heute auch, dass diese nicht statisch sind, sondern einige von ihnen dynamischen Regulationsprozessen der Zelle unterliegen. Eine dieser dynamisch regulierten RNA-Modifikationen ist das m6A. Die Methylgruppe am N6 des N6-Methyladenosins kann durch die Eraser-Enzyme FTO und ALKBH5 oxidativ entfernt werden. Neben m6A kann FTO aber auch die Methylgruppe an Modifikationen wie dem m6Am, m1A entfernen. Bei ALKBH5 hingegen sind über das m6A hinaus, keine weiteren Substrate bekannt. In dieser Arbeit wurde gezeigt das ALKBH566-292 neben m6A auch die ribosomale Modifikation N6,N6-Dimethyladenosin (m62A) vollständig demethylieren kann. 2-Methylthioadenosin (ms2A) ist eine RNA-Modifikation, welche anders als m6A, bisher nicht ausgiebig studiert wurde. Die Literatur lässt darauf schließen, dass die Verbindung in tRNAs vorkommt. In dem Organismus Escherichia coli (E.coli), ist neben ms2A mit dem 2-Methylthio-N6-isopentenyladenosine (ms2i6A), nur eine weitere tRNA-Modifikation bekannt, welche an der C2-Position thiomethyliert ist. Das ms2i6A wird durch die Thiomethyltransferase MiaB dargestellt und unterscheidet sich von ms2A durch eine Prenylgruppe an dem exozyklischen Stickstoff an Position sechs. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob das ms2A das Produkt einer enzymatischen Entfernung dieser Prenylgruppe ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass dies wahrscheinlich der Fall ist (Abb. 0.2). Das Enzym, welches die Prenylgruppe des ms2i6A entfernen kann, wurde in dieser Arbeit nicht gefunden. Allerdings konnte die Liste infrage kommender Genprodukte, durch die Untersuchung von E.coli Knockoutstämmen, auf unter 99 reduziert werden. Queuosin ist eine lang bekannte und gut studierte tRNA-Modifikation. Interessanterweise kann sie ausschließlich von Prokaryoten dargestellt werden, kommt aber auch in Eukaryoten vor. In letzteren kann das Queuosin der Tyrosin- und Asparaginsäure-tRNA weiter zu β-Galaktosyl- bzw. β-Mannosylqueuosin derivatisiert werden. Die Strukturen beider Derivate wurde 1976 veröffentlicht, jedoch wurde die Struktur des β-Mannosylqueuosins von Thumbs falsifiziert. In der hier vorliegenden Arbeit konnte in Zellexperimenten, über Mannose-13C6 gezeigt werden, dass es sich bei dem Queuosinderivat in der tRNAAsp tatsächlich um Mannosylqueuosin handelt. Infolgedessen wurden Koinjektionsversuche durchgeführt, bei denen verschiedene synthetische Mannosylqueuosinstandards zusammen mit Gesamt-RNA aus Maus auf ein Massenspektrometer injiziert wurden. Die Versuchsreihen waren zum Zeitpunkt dieser Arbeit nicht vollständig abgeschlossen. Die in dieser Arbeit vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass es sich bei dem Mannosylqueuosin in der tRNAAsp wahrscheinlich um α-Homo-allyl-mannosylqueuosin handelt. Während die de novo Synthese von Queuosin und seinen Derivaten in Prokaryoten vollständig aufgeklärt ist, ist dies in Eukaryoten nicht der Fall. So ist das Enzym, welches α-Mannosylqueuosin darstellt, nicht bekannt. In einer Veröffentlichung von 1976 wurde von einer enzymatischen Aktivität in Rattenleberextrakt berichtet, welche spezifisch das Queuosin der E.coli tRNAAsp mannosylieren kann. In der hier vorliegenden Arbeit wurde ein Experiment auf der Grundlage dieser Veröffentlichung durchgeführt. Jedoch konnte die enzymatische Aktivität in diesen Experimenten nicht beobachtet werden. In dieser Arbeit wurden die Queuosin-, Mannosylqueuosin- und Galaktosylqueuosin-Level zum ersten Mal in sechs verschiedenen Mäuseorganen zu zwei verschiedenen Alterszeitpunkten quantifiziert. Die Alterszeitpunkte sind ein Tag nach der Geburt und drei Monate und fünf Tage nach der Geburt. Hier hat sich gezeigt, dass die Level des Mannosyl- und Galaktosylqueuosins sich mit dem Alter moderater verändern als die des Queuosins. Dieser stärkere Anstieg des Queuosins scheint dabei mit dem Anteil an mitochondrialer tRNA zusammenzuhängen. In Mitochondrien wird das Queuosin, anders als im Zytosol, nicht weiter derivatisiert. Bei allen drei Modifikationen hat sich allerdings gezeigt, dass der Unterschied zwischen Organen größer ist als die Veränderung über das Alter hinweg. So sind die Level in Groß-, Kleinhirn und Herz in der Tendenz höher als in der Niere, Leber und Milz. Die Literatur zeigt, dass die letzten drei Organe eine höhere Proteinsyntheserate haben. Daraus ergibt sich die Vermutung, dass die Q-tRNAs in diesen Organen untermodifziert sind. Der Modifikationsgrad dieser tRNAs scheint mit einer höheren Proteinsyntheserate tendenziell abzunehmen.

Abstract

Ribonucleic acid (RNA) is based on the four canonical nucleic acids. In the cell, those four nucleic acids can be further functionalised. The first modification was already discovered in 1957 and is today known as pseudouridin. Currently there are 163 modifications registered in the Modomics database. Beside the steadily rising number of known RNA-modifications, we today now that some of them are not static, but that some of them are affected by dynamic regulatory processes of the cell. One of these dynamically regulated RNA-modifications is m6A. The methyl group, located at the N6, of the N6- methyladenosine can be removed in an oxidative process by the Eraser-enzymes FTO and ALKBH5. Beside m6A, FTO is also able to remove the methyl group of modifications such as m6Am, m1A. Apart from m6A there are no known other substrates for ALKBH5. This work presents data showing, that ALKBH566-292 is able, to fully demethylate the ribosomal modification N6,N6-dimethyladenosine (m62A). 2-Methylthioadenosine (ms2A) is a RNA-modification that, unlike m6A, is not well studied. Literature suggests, that it is present in tRNAs. In the organism Escherichia coli (E.coli), there is beside 2-methylthio-N6-isopentenyl-adenosine (ms2i6A), only ms2i6A, which is thiomethylated at the C2 position. ms2i6A is synthesized by the thiomethyltransferase MiaB. In contrast to ms2A, it is modified with a prenyl group at the nitrogen at position six. In this thesis it was studied, if ms2A is the product of an enzymatic removal of the prenyl group. The results indicate that this is probably the case (Fig. 0.1). The enzyme responsible for the removal of ms2i6A’s prenyl group, was not identified, but the number of candidates was reduced to less than 99 gene products by studying E.coli knockout strains. Queuosine is a long known and well-studied tRNA modification. Interestingly it can only be synthesized by procaryotes but it is also found in eucaryotes. In the latter case, the queuosine of the tyrosine and aspartic acid tRNA can be further modified to β-galactosyl- and β-mannosyl-queuosine, respectively. The structure of the derivates was published in 1976, but the structure of β-mannosyl-queuosine, was falsified by Thumbs. In this thesis, experiments with mannose-13C6 in cells show, that the queuosine in tRNAAsp is indeed mannosyl-queuosine. Furthermore, a series of experiments where conducted with different synthetic mannosyl-queuosin standards, which where coinjected with total RNA isolated from mice. The series of experiments is currently not complete for a final conclusion. The results of the already conducted experiments indicate that there is probability, that the mannsyl-queuosine of the tRNAAsp is α-homo-allyl-mannosyl-queuosine. While the de novo synthesis of queuosine and its derivates is thourougly studied in procaryotes, that is not the case for eucaryotes. The enzyme which synthesizes α-mannosylqueuosine is not known. A publication from 1976 reported an enzymatic activity in rat liver extract, which specifically mannosylated queuosine in E.coli tRNAAsp. In this thesis I conducted experiments based upon this publication. The reported actvity, however was not observed. I therefore continued to invesitgate the modification levels of queuosine, mannosyl- and galactosyl-queuosine quantitatively in mice at to different ages and in six different organs. The age points were one day after birth and three months and five days after birth. The obtained data show, that mannosyl- and galactosyl-queuosine levels change less with age than queuosine. This strong change of queuosine seems to be correlating with the amount of mitochondrial tRNA. In mitochondria, different to the cytosol, queuosine is not further derivatised. All the modifications levels do differ more across organs than over time. The levels are generally higher in the cerebrum, cerebellum and heart than in the kidney, liver and spleen. According to literature the latter three organs have a higher fractional protein synthesis rate. It seems likely that the Q-tRNAs in these organs are undermodified. Lower levels of modification might be correlating with a higher fractional protein synthesis rate.