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Probes, hardware and software for next-generation super-resolution microscopy
Probes, hardware and software for next-generation super-resolution microscopy
Super-resolution microscopy enables optical imaging using fluorescence probes below the diffraction limit. In stochastic super-resolution microscopy, molecules are „switched“ between non-fluorescent dark-state (OFF-state) and fluorescent bright-state (ON-state) in order to pinpoint their position with sub-diffraction precision. The most prominent techniques of localization-based super-resolution microscopy are photo-activated localization microscopy (PALM) and stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Here, the switching between dark- and bright-state is accomplished using photophysical or photochemical processes. A recently introduced super-resolution microscopy method called DNA-PAINT (deoxyribonucleic acid - point accumulation for imaging in nanoscale topography) is based on DNA-DNA interaction. In contrast to STORM or PALM, the fluorescence molecules do not switch between dark and bright states. The so-called „blinking“ in DNA-PAINT is created by transient hybridization of short fluorescent DNA strands (imagers) to their targets. The work in this dissertation focuses on three different advancements in the technological aspect of super-resolution microscopy. Probes In the first project of this thesis, I demonstrate the combination of single-molecule Förster resonance energy transfer (FRET) with DNA-PAINT imaging to overcome some current limitations of the DNA-based super-resolution microscopy. I evaluate the novel probe design with in vitro experiments using DNA nanostructures and prove the performance of the FRET-based probes in a cellular context. Hardware In the second project, I describe a cost-efficient single-molecule microscope platform, which is an order of magnitude more affordable, while still yielding high-performance imaging capacity. Using two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) super-resolution in vitro experiments using DNA nanostructures, I asses the performance of the microscopy platform. Finally, I present exemplary experiments for multiplexed cellular imaging. Software In the last project, I present a software package that is developed to assist during super-resolution data analysis. It is based on the deep learning concept of the artificial neural network (ANN) and designed to automate the classification of nano-scaled patterns found in super-resolution images. I evaluate the performance of the software package using super-resolution in vitro experiments of DNA nanostructures as well as targets in cellular samples., Die superauflösende Mikroskopie ermöglicht die optische Abbildung mittels Fluoreszenzsonden unterhalb der Beugungsgrenze. In stochastischen Superauflösungsmikroskopie werden Moleküle zwischen dem nicht-fluoreszierenden Zustand (OFF-Zustand) und dem fluoreszierenden Zustand (ON-Zusstand) “geschaltet“, um ihre Position präziser als die Beugungsgrenze zu bestimmen. Die bekanntesten Mikroskopietechniken der lokalisationsbasierten Superauflösungsmikroskopie sind photo-activated localization microscopy (PALM) und stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Hier wird die Umschaltung zwischen Dunkel- und Hellzustand mithilfe photophysikalischer oder photochemischer Prozesse durchgeführt. Eine kürzlich eingeführte Methode der Superauflösungsmikroskopie namens DNA-PAINT (deoxyribonucleic acid - point accumulation for imaging in nanoscale topography) basiert auf der DNA-DNA Wechselwirkung. Im Vergleich zu STORM oder PALM wechseln die Fluoreszenzmoleküle nicht zwischen dem dunklen und dem hellen Zustand. Das sogenannte “Blinken“ in DNA-PAINT wird durch transiente Hybridisierung kurzer fluoreszierender DNA Stränge (Imager) an ihre Ziele erzeugt. Die Arbeiten in dieser Dissertation konzentriert sich auf drei unterschiedliche Fortschritte im technologischen Aspekt der Superauflösungsmikroskopie. Sonden Im ersten Projekt dieser Arbeit zeige ich die Kombination von Einzelmolekül-Förster-Resonanzenergietransfer (englisch Förster resonance energy transfer (FRET)) mit DNA-PAINT Mikroskopie, um einige aktuelle Einschränkungen der DNA basierten Superauflösungsmikroskopie zu überwinden. Ich evaluiere das neuartige Sondendesign mithilfe von in vitro Experimenten mit DNA nanostructure und zeige die Leistungsfähigkeit der FRET-basierten Sonden im zellulären Kontext. Hardware Im zweiten Projekt beschreibe ich eine kosteneffiziente Mikroskop-Plattform für Einzelmolekülstudien, die um eine Größenordnung erschwinglicher ist und dennoch eine leistungsstarke Abbildungsfähigkeit bietet. Unter Verwendung von zweidimensionalen (2D) und dreidimensionalen (3D) in vitro Superauflösungsexperimenten von DNA Nanostrukturen bewerte ich die Leistung der Mikroskopie-Plattform. Schließlich zeige ich exemplarische Experimente für die zelluläre Bildgebung in mehreren Farben. Software Im letzten Projekt stelle ich ein Softwarepaket vor, das zur Unterstützung der Analyse von Daten in Superauflösungsmikroskopie entwickelt wurde. Es basiert auf dem Konzept des tiefen Lernens (englisch deep learning) mithilfe von künstlichen neuronalen Netzen und wurde entwickelt, um die Klassifikation von nanoskaligen Mustern zu automatisieren, die in superaufgelösten Bildern zu finden sind. Ich evaluiere die Leistung des Softwarepakets anhand von in vitro Superauflösungsexperimenten von DNA Nanostrukturen sowie von in Zellproben.
Super-Resolution Microscopy, DNA nanotechnology, Deep learning
Auer, Alexander
2020
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Auer, Alexander (2020): Probes, hardware and software for next-generation super-resolution microscopy. Dissertation, LMU München: Faculty of Physics
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Abstract

Super-resolution microscopy enables optical imaging using fluorescence probes below the diffraction limit. In stochastic super-resolution microscopy, molecules are „switched“ between non-fluorescent dark-state (OFF-state) and fluorescent bright-state (ON-state) in order to pinpoint their position with sub-diffraction precision. The most prominent techniques of localization-based super-resolution microscopy are photo-activated localization microscopy (PALM) and stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Here, the switching between dark- and bright-state is accomplished using photophysical or photochemical processes. A recently introduced super-resolution microscopy method called DNA-PAINT (deoxyribonucleic acid - point accumulation for imaging in nanoscale topography) is based on DNA-DNA interaction. In contrast to STORM or PALM, the fluorescence molecules do not switch between dark and bright states. The so-called „blinking“ in DNA-PAINT is created by transient hybridization of short fluorescent DNA strands (imagers) to their targets. The work in this dissertation focuses on three different advancements in the technological aspect of super-resolution microscopy. Probes In the first project of this thesis, I demonstrate the combination of single-molecule Förster resonance energy transfer (FRET) with DNA-PAINT imaging to overcome some current limitations of the DNA-based super-resolution microscopy. I evaluate the novel probe design with in vitro experiments using DNA nanostructures and prove the performance of the FRET-based probes in a cellular context. Hardware In the second project, I describe a cost-efficient single-molecule microscope platform, which is an order of magnitude more affordable, while still yielding high-performance imaging capacity. Using two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) super-resolution in vitro experiments using DNA nanostructures, I asses the performance of the microscopy platform. Finally, I present exemplary experiments for multiplexed cellular imaging. Software In the last project, I present a software package that is developed to assist during super-resolution data analysis. It is based on the deep learning concept of the artificial neural network (ANN) and designed to automate the classification of nano-scaled patterns found in super-resolution images. I evaluate the performance of the software package using super-resolution in vitro experiments of DNA nanostructures as well as targets in cellular samples.

Abstract

Die superauflösende Mikroskopie ermöglicht die optische Abbildung mittels Fluoreszenzsonden unterhalb der Beugungsgrenze. In stochastischen Superauflösungsmikroskopie werden Moleküle zwischen dem nicht-fluoreszierenden Zustand (OFF-Zustand) und dem fluoreszierenden Zustand (ON-Zusstand) “geschaltet“, um ihre Position präziser als die Beugungsgrenze zu bestimmen. Die bekanntesten Mikroskopietechniken der lokalisationsbasierten Superauflösungsmikroskopie sind photo-activated localization microscopy (PALM) und stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Hier wird die Umschaltung zwischen Dunkel- und Hellzustand mithilfe photophysikalischer oder photochemischer Prozesse durchgeführt. Eine kürzlich eingeführte Methode der Superauflösungsmikroskopie namens DNA-PAINT (deoxyribonucleic acid - point accumulation for imaging in nanoscale topography) basiert auf der DNA-DNA Wechselwirkung. Im Vergleich zu STORM oder PALM wechseln die Fluoreszenzmoleküle nicht zwischen dem dunklen und dem hellen Zustand. Das sogenannte “Blinken“ in DNA-PAINT wird durch transiente Hybridisierung kurzer fluoreszierender DNA Stränge (Imager) an ihre Ziele erzeugt. Die Arbeiten in dieser Dissertation konzentriert sich auf drei unterschiedliche Fortschritte im technologischen Aspekt der Superauflösungsmikroskopie. Sonden Im ersten Projekt dieser Arbeit zeige ich die Kombination von Einzelmolekül-Förster-Resonanzenergietransfer (englisch Förster resonance energy transfer (FRET)) mit DNA-PAINT Mikroskopie, um einige aktuelle Einschränkungen der DNA basierten Superauflösungsmikroskopie zu überwinden. Ich evaluiere das neuartige Sondendesign mithilfe von in vitro Experimenten mit DNA nanostructure und zeige die Leistungsfähigkeit der FRET-basierten Sonden im zellulären Kontext. Hardware Im zweiten Projekt beschreibe ich eine kosteneffiziente Mikroskop-Plattform für Einzelmolekülstudien, die um eine Größenordnung erschwinglicher ist und dennoch eine leistungsstarke Abbildungsfähigkeit bietet. Unter Verwendung von zweidimensionalen (2D) und dreidimensionalen (3D) in vitro Superauflösungsexperimenten von DNA Nanostrukturen bewerte ich die Leistung der Mikroskopie-Plattform. Schließlich zeige ich exemplarische Experimente für die zelluläre Bildgebung in mehreren Farben. Software Im letzten Projekt stelle ich ein Softwarepaket vor, das zur Unterstützung der Analyse von Daten in Superauflösungsmikroskopie entwickelt wurde. Es basiert auf dem Konzept des tiefen Lernens (englisch deep learning) mithilfe von künstlichen neuronalen Netzen und wurde entwickelt, um die Klassifikation von nanoskaligen Mustern zu automatisieren, die in superaufgelösten Bildern zu finden sind. Ich evaluiere die Leistung des Softwarepakets anhand von in vitro Superauflösungsexperimenten von DNA Nanostrukturen sowie von in Zellproben.