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Validierung von OCT-Befunden am hinteren Augensegment von Greifvögeln mittels Konfokalmikroskopie
Validierung von OCT-Befunden am hinteren Augensegment von Greifvögeln mittels Konfokalmikroskopie
Die optische Kohärenztomographie (OCT) erweist sich in der Humanophthalmologie als unverzichtbares Werkzeug zur Diagnostik von Augenerkrankungen und gilt hier als Goldstandard zur Erkennung von Retinopathien. Der Einsatz der OCT erfährt in den letzten Jahren auch immer mehr Zuspruch in der Tiermedizin. Gerade bei Vögeln, bei denen das Auge das wichtigste Sinnesorgan darstellt, ist der Einsatz dieser Technik von großem diagnostischem und experimentellem Interesse. Das Ziel der vorliegenden Studie war die Validierung von OCT-Aufnahmen der Retina in der aviären Augenheilkunde. Hierfür wurde erstmals eine Punkt-zu- Punkt-Vermessung und -Vergleich der OCT mit der Histologie durchgeführt. Dabei gingen 50 Augen von 27 Greifvögeln in die OCT-Untersuchung ein. Bei den Patienten handelte es sich um wildlebende Greifvögel, welche von November 2017 bis Dezember 2018 in eine Vogelklinik eingeliefert worden sind. Die OCT-Aufnahmen wurden mit einem SPECTRALIS® HRA+OCT (Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany) aufgenommen und mit der Software Heidelberg Eye Explorer 1.10.2.0. vermessen. Die Tiere wurden aufgrund infauster Prognose aus tierschutzrechtlichen Gründen anschließend euthanasiert und die Augen für eine histologische Untersuchung entnommen. Für die histologische Untersuchung wurde die Retina immunhistochemisch markiert und mit einem OLYMPUS BX51WI Mikroskop mit einer OLYMPUS BX-DSU (Olympus; Tokio, Japan) konfokalmikroskopisch dokumentiert. Die Aufnahmen wurden mit der Stereo Investigator Software 11.02.01 (MBF Science, Williston, USA) ausgewertet. Sowohl in der OCT als auch in der konfokalmikroskopischen Aufnahme wurden die Tiefe der Foveae vermessen und die Schichtdicken der Internal Limiting Membrane + Nerve Fiber Layer + Ganglion Cell Layer, die Inner Plexiform Layer, die Inner Nuclear Layer + Outer Plexiform Layer + Outer Nuclear Layer + External Limiting Membrane, das Inner Segment der Zapfenschicht sowie die Gesamtdicke der Retina (Internal Limiting Membrane bis Inner Segment). Dabei fungierte die Fovea centralis als Orientierungspunkt in beiden Aufnahmen. Die OCT-Untersuchung fand am wachen Patienten statt, ohne eine Sedierung. In Einzelfällen wurde eine Schmerzmedikation mit Butorphanol (4mg/kg KM) durchgeführt. Um die Reproduzierbarkeit der OCT zu bestimmen, wurden zwei Aufnahmen vermessen. Dabei ergab sich für die OCT eine hervorragende Reproduzierbarkeit (Gesamtdicke der Retina 1,3 %). Für den Vergleich der OCT mit der Histologie konnten insgesamt 319 Messungen von 30 gesunden Augen von vier verschiedenen Vogelspezies eingehen. Der Vergleich ergab eine geringe Übereinstimmung beider Methoden. Der Hauptgrund hierfür ist in der grundlegend abweichenden Technik beider Verfahren zu suchen. Die OCT stellt die optischen Eigenschaften zellulärer Strukturen dar, wohingegen die Immunhistochemie einzeln markierte Zellen visualisiert. Der Zusammenhang zwischen individuellen zellulären Strukturen und ihren optischen Eigenschaften ist weitestgehend unbekannt und weitere Studien hierzu notwendig. Das Vogelauge weist zudem zahlreiche Besonderheiten im Vergleich zum menschlichen Auge auf. Trotz der geringen Übereinstimmung der Werte mit der Histologie, stimmten die sichtbaren Veränderungen und Trends in der OCT mit der Histologie überein. Die OCT ermöglicht eine sichere und verlässliche Methode, um pathologische Abweichungen zu detektieren. In der vorliegenden Studie wurden erstmals Läsionen im zeitlichen Verlauf bei drei Waldkäuzen (Strix aluco) und einem Mäusebussard (Buteo buteo) dargestellt und der Nutzen der OCT zur Überwachung und Untersuchung von Retinaalterationen dargestellt. Aufgrund der Ergebnisse ist die optische Kohärenztomographie als ein wichtiges diagnostisches Mittel in der aviären Augenheilkunde anzusehen. Es ermöglicht Abweichungen sicher zu detektieren und diese im zeitlichen Verlauf zu dokumentieren, pathologische Prozesse zu verstehen und Prognosen besser zu evaluieren. Es ist dringend notwendig in zukünftigen Studien weitere pathologische Abweichungen in der OCT zu beschreiben, vor allem im Zusammenhang mit der Bedeutung für den Visus. Zukünftig sollten weitere Veränderungen mit der Histologie abgeglichen werden, um die zellulären Mechanismen besser zu verstehen und somit auch die Bedeutung für die Sehkraft. Die Studie liefert hierfür ein Basisprotokoll zur immunhistochemischen Markierung der aviären Retina bei tag- und nachaktiven Vögeln. In künftigen Studien sollte die OCT ebenso Einsatz zur Untersuchung von Infektionserkrankungen und ihre okularen Manifestationen im zeitlichen Verlauf (z.B. West-Nile-Virus oder Bornavirus) finden und könnte ebenso bei der Fragestellung eines lichtinduziertes Glaukoms Anwendung finden., Optical coherence tomography (OCT) has proven to be an indispensable tool in human ophthalmology for the diagnosis of eye diseases and is regarded as the gold standard for the detection of retinopathies. In recent years, the use of OCT gained increasing popularity in veterinary medicine. Especially in birds, where the eye is the most important sensory organ, the use of this technique is of great diagnostic and experimental interest. The aim of the study was to validate OCT images of the retina in avian ophthalmology. To achieve this, a point-to-point measurement and comparison of OCT with histology was performed for the first time. 50 eyes of 27 birds of prey were included in the OCT examination. The patients were wild birds of prey who were admitted to an avian clinic from November 2017 to December 2018. The OCT images were taken with a SPECTRALIS® HRA+OCT (Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany) and measured with the Heidelberg Eye Explorer 1.10.2.0 software. The animals were euthanized due to an infaust prognosis and for reasons of animal welfare. In those cases the eyes were removed for histological examination. For histological examination, the retina was immunohistochemically labelled and confocally imaged with an OLYMPUS BX51WI microscope and an OLYMPUS BX-DSU (Olympus; Tokyo, Japan) confocal microscope. The images were evaluated with the Stereo Investigator Software 11.02.01 (MBF Science, Williston, USA). In both OCT and confocal microscopy, the depth of the foveae and the layer thicknesses of the Internal Limiting Membrane + Nerve Fiber Layer + Ganglion Cell Layer, the Inner Plexiform Layer, the Inner Nuclear Layer + Outer Plexiform Layer + Outer Nuclear Layer + External Limiting Membrane, the Inner Segment of the cone layer as well as the total thickness of the retina (Internal Limiting Membrane to Inner Segment) were measured. The fovea centralis served as an orientation point in both images. The OCT examination was performed on the awake patient without sedation. In individual cases, pain medication with butorphanol (4mg/kg KM) was administered. To determine the reproducibility of the OCT, two images were measured, resulting in excellent reproducibility for OCT (total retinal thickness 1.3%). To compare OCT with histology, a total of 319 measurements from 30 healthy eyes of four different bird species were obtained. The comparison showed a low agreement between the two methods. The main reason causing this poor agreement is the fundamentally different technique of both methods. OCT represents the optical properties of cellular structures, whereas immunohistochemistry visualizes individually labelled cells. The relationship between individual cellular structures and their optical properties is largely unknown and further studies are necessary. The birds eye also has numerous special features compared to the human eye. Despite the low agreement of the values achieved by OCT and histology, the visible changes and trends in OCT were reliable and corresponded with histological findings. OCT provides a safe and reliable method to detect pathological abnormalities. This study was the first to show a follow up examination in three forest owls (Strix aluco) and one buzzard (Buteo buteo) that demonstrated the benefits of OCT for monitoring and investigating retinal alterations. Based on the results, optical coherence tomography is an important diagnostic tool in avian ophthalmology. It enables the reliable detection of abnormalities, an improved understanding of pathological processes and their trends over a period, as well as a better evaluation of prognoses. It is necessary to describe further pathological alterations visible in OCT in future studies, especially their impact and importance for visual acuity. In the future, more abnormalities should be compared with histology in order to understand ultrastructural mechanisms and their relevance for vision. For this purpose, the study provides a basic protocol for the immunohistochemical labelling of the avian retina in diurnal and nocturnal birds. Future studies should also include OCT-investigations of infectious diseases and their ocular manifestations (e.g. West-Nile-Virus or Bornavirus). Cases of light-induced glaucoma as a relevant animal welfare subject could also be investigated by OCT in further studies.
Optical coherence tomography, Histology, Confocal Laser Scanning Microscopy, Birds of prey, Retina, Optische Kohärenztomographie, Histologie, konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie, Greifvogel
Hagen, Elisabeth
2020
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Hagen, Elisabeth (2020): Validierung von OCT-Befunden am hinteren Augensegment von Greifvögeln mittels Konfokalmikroskopie. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Die optische Kohärenztomographie (OCT) erweist sich in der Humanophthalmologie als unverzichtbares Werkzeug zur Diagnostik von Augenerkrankungen und gilt hier als Goldstandard zur Erkennung von Retinopathien. Der Einsatz der OCT erfährt in den letzten Jahren auch immer mehr Zuspruch in der Tiermedizin. Gerade bei Vögeln, bei denen das Auge das wichtigste Sinnesorgan darstellt, ist der Einsatz dieser Technik von großem diagnostischem und experimentellem Interesse. Das Ziel der vorliegenden Studie war die Validierung von OCT-Aufnahmen der Retina in der aviären Augenheilkunde. Hierfür wurde erstmals eine Punkt-zu- Punkt-Vermessung und -Vergleich der OCT mit der Histologie durchgeführt. Dabei gingen 50 Augen von 27 Greifvögeln in die OCT-Untersuchung ein. Bei den Patienten handelte es sich um wildlebende Greifvögel, welche von November 2017 bis Dezember 2018 in eine Vogelklinik eingeliefert worden sind. Die OCT-Aufnahmen wurden mit einem SPECTRALIS® HRA+OCT (Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany) aufgenommen und mit der Software Heidelberg Eye Explorer 1.10.2.0. vermessen. Die Tiere wurden aufgrund infauster Prognose aus tierschutzrechtlichen Gründen anschließend euthanasiert und die Augen für eine histologische Untersuchung entnommen. Für die histologische Untersuchung wurde die Retina immunhistochemisch markiert und mit einem OLYMPUS BX51WI Mikroskop mit einer OLYMPUS BX-DSU (Olympus; Tokio, Japan) konfokalmikroskopisch dokumentiert. Die Aufnahmen wurden mit der Stereo Investigator Software 11.02.01 (MBF Science, Williston, USA) ausgewertet. Sowohl in der OCT als auch in der konfokalmikroskopischen Aufnahme wurden die Tiefe der Foveae vermessen und die Schichtdicken der Internal Limiting Membrane + Nerve Fiber Layer + Ganglion Cell Layer, die Inner Plexiform Layer, die Inner Nuclear Layer + Outer Plexiform Layer + Outer Nuclear Layer + External Limiting Membrane, das Inner Segment der Zapfenschicht sowie die Gesamtdicke der Retina (Internal Limiting Membrane bis Inner Segment). Dabei fungierte die Fovea centralis als Orientierungspunkt in beiden Aufnahmen. Die OCT-Untersuchung fand am wachen Patienten statt, ohne eine Sedierung. In Einzelfällen wurde eine Schmerzmedikation mit Butorphanol (4mg/kg KM) durchgeführt. Um die Reproduzierbarkeit der OCT zu bestimmen, wurden zwei Aufnahmen vermessen. Dabei ergab sich für die OCT eine hervorragende Reproduzierbarkeit (Gesamtdicke der Retina 1,3 %). Für den Vergleich der OCT mit der Histologie konnten insgesamt 319 Messungen von 30 gesunden Augen von vier verschiedenen Vogelspezies eingehen. Der Vergleich ergab eine geringe Übereinstimmung beider Methoden. Der Hauptgrund hierfür ist in der grundlegend abweichenden Technik beider Verfahren zu suchen. Die OCT stellt die optischen Eigenschaften zellulärer Strukturen dar, wohingegen die Immunhistochemie einzeln markierte Zellen visualisiert. Der Zusammenhang zwischen individuellen zellulären Strukturen und ihren optischen Eigenschaften ist weitestgehend unbekannt und weitere Studien hierzu notwendig. Das Vogelauge weist zudem zahlreiche Besonderheiten im Vergleich zum menschlichen Auge auf. Trotz der geringen Übereinstimmung der Werte mit der Histologie, stimmten die sichtbaren Veränderungen und Trends in der OCT mit der Histologie überein. Die OCT ermöglicht eine sichere und verlässliche Methode, um pathologische Abweichungen zu detektieren. In der vorliegenden Studie wurden erstmals Läsionen im zeitlichen Verlauf bei drei Waldkäuzen (Strix aluco) und einem Mäusebussard (Buteo buteo) dargestellt und der Nutzen der OCT zur Überwachung und Untersuchung von Retinaalterationen dargestellt. Aufgrund der Ergebnisse ist die optische Kohärenztomographie als ein wichtiges diagnostisches Mittel in der aviären Augenheilkunde anzusehen. Es ermöglicht Abweichungen sicher zu detektieren und diese im zeitlichen Verlauf zu dokumentieren, pathologische Prozesse zu verstehen und Prognosen besser zu evaluieren. Es ist dringend notwendig in zukünftigen Studien weitere pathologische Abweichungen in der OCT zu beschreiben, vor allem im Zusammenhang mit der Bedeutung für den Visus. Zukünftig sollten weitere Veränderungen mit der Histologie abgeglichen werden, um die zellulären Mechanismen besser zu verstehen und somit auch die Bedeutung für die Sehkraft. Die Studie liefert hierfür ein Basisprotokoll zur immunhistochemischen Markierung der aviären Retina bei tag- und nachaktiven Vögeln. In künftigen Studien sollte die OCT ebenso Einsatz zur Untersuchung von Infektionserkrankungen und ihre okularen Manifestationen im zeitlichen Verlauf (z.B. West-Nile-Virus oder Bornavirus) finden und könnte ebenso bei der Fragestellung eines lichtinduziertes Glaukoms Anwendung finden.

Abstract

Optical coherence tomography (OCT) has proven to be an indispensable tool in human ophthalmology for the diagnosis of eye diseases and is regarded as the gold standard for the detection of retinopathies. In recent years, the use of OCT gained increasing popularity in veterinary medicine. Especially in birds, where the eye is the most important sensory organ, the use of this technique is of great diagnostic and experimental interest. The aim of the study was to validate OCT images of the retina in avian ophthalmology. To achieve this, a point-to-point measurement and comparison of OCT with histology was performed for the first time. 50 eyes of 27 birds of prey were included in the OCT examination. The patients were wild birds of prey who were admitted to an avian clinic from November 2017 to December 2018. The OCT images were taken with a SPECTRALIS® HRA+OCT (Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany) and measured with the Heidelberg Eye Explorer 1.10.2.0 software. The animals were euthanized due to an infaust prognosis and for reasons of animal welfare. In those cases the eyes were removed for histological examination. For histological examination, the retina was immunohistochemically labelled and confocally imaged with an OLYMPUS BX51WI microscope and an OLYMPUS BX-DSU (Olympus; Tokyo, Japan) confocal microscope. The images were evaluated with the Stereo Investigator Software 11.02.01 (MBF Science, Williston, USA). In both OCT and confocal microscopy, the depth of the foveae and the layer thicknesses of the Internal Limiting Membrane + Nerve Fiber Layer + Ganglion Cell Layer, the Inner Plexiform Layer, the Inner Nuclear Layer + Outer Plexiform Layer + Outer Nuclear Layer + External Limiting Membrane, the Inner Segment of the cone layer as well as the total thickness of the retina (Internal Limiting Membrane to Inner Segment) were measured. The fovea centralis served as an orientation point in both images. The OCT examination was performed on the awake patient without sedation. In individual cases, pain medication with butorphanol (4mg/kg KM) was administered. To determine the reproducibility of the OCT, two images were measured, resulting in excellent reproducibility for OCT (total retinal thickness 1.3%). To compare OCT with histology, a total of 319 measurements from 30 healthy eyes of four different bird species were obtained. The comparison showed a low agreement between the two methods. The main reason causing this poor agreement is the fundamentally different technique of both methods. OCT represents the optical properties of cellular structures, whereas immunohistochemistry visualizes individually labelled cells. The relationship between individual cellular structures and their optical properties is largely unknown and further studies are necessary. The birds eye also has numerous special features compared to the human eye. Despite the low agreement of the values achieved by OCT and histology, the visible changes and trends in OCT were reliable and corresponded with histological findings. OCT provides a safe and reliable method to detect pathological abnormalities. This study was the first to show a follow up examination in three forest owls (Strix aluco) and one buzzard (Buteo buteo) that demonstrated the benefits of OCT for monitoring and investigating retinal alterations. Based on the results, optical coherence tomography is an important diagnostic tool in avian ophthalmology. It enables the reliable detection of abnormalities, an improved understanding of pathological processes and their trends over a period, as well as a better evaluation of prognoses. It is necessary to describe further pathological alterations visible in OCT in future studies, especially their impact and importance for visual acuity. In the future, more abnormalities should be compared with histology in order to understand ultrastructural mechanisms and their relevance for vision. For this purpose, the study provides a basic protocol for the immunohistochemical labelling of the avian retina in diurnal and nocturnal birds. Future studies should also include OCT-investigations of infectious diseases and their ocular manifestations (e.g. West-Nile-Virus or Bornavirus). Cases of light-induced glaucoma as a relevant animal welfare subject could also be investigated by OCT in further studies.