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Identification of cellular long non-coding RNAs regulated by the EBV nuclear antigen EBNA2
Identification of cellular long non-coding RNAs regulated by the EBV nuclear antigen EBNA2
Epstein-Barr virus (EBV), the fourth most common infectious carcinogen for humans, can establish a life-long latency in the host B cells, with such latent infection associated with various B cell malignancies. The infection of B lymphocytes by EBV in vitro results in transformation and unlimited proliferation of a so called lymphoblastoide cell line (LCLs). This transformation is driven by EBV nuclear antigens (EBNAs), in addition to other factors. These include EBNA2 (E2) and EBNA3A (E3A), which are co-expressed transcription factors (TFs) competing for binding to a well-studied anchor C promoter binding factor (CBF1). E2 and E3A have been shown to share cellular target genes, including several long non-coding RNAs (lncRNAs). LncRNAs are key transcriptional regulators, associated with a huge variety of diseases including cancer. Herein, we comprehensively assessed the E2 and E3A dependent gene regulation in a transcriptomic analysis by RNA-Seq. We focused on E2 target gene regulation with particular emphasis on known and novel lncRNAs. Our results show that E2 and E3A regulated target genes cluster genome-wide in co-regulated gene blocks (CRGBs). These CRGBs consist of both protein-coding and lncRNA genes. Candidate target genes were confirmed by RT-qPCR and demonstrated to be regulated during the establishment of latency following EBV infection. Several of these lncRNAs were reported to be dysregulated in various cancer types. Further, we demonstrated that the regulation of lncRNAs and the closest protein-coding gene correlates positively, supporting the possibility that E2 induced lncRNAs regulate remote protein-coding genes. We discovered that E2 regulated lncRNAs annotated by public available genome databases in both the nucleus and the cytoplasm. Additionally, we detected intergenic transcribed genes (unannotated by ENSEMBL) enriched in the nucleus. To some extent, these intergenic transcribed genes were not covered by the comprehensive lncRNA database LNCat and can thus be defined as novel. To determine direct E2 target genes and that of other transcription factors induced by E2, we profiled E2 differentially regulated genes with competent and inhibited protein synthesis. 3 % of the E2 target genes were regulated with absent de novo protein synthesis, including several lncRNAs largely emanating from enhancer marked chromatin, indicating that 97% of E2 targets are indirect targets. We found, that up to 70 % of the shared target genes of E2 and E3A were counter-regulated. Finally, we assessed first effects of E2 and E3A on the viral transcriptome finding an induction of lytic genes. In an independent study, we were able to functionally confirm the contribution of early B cell factor 1 EBF1 to chromatin binding of E2 at CBF1 independent binding sites. In conclusion, our data indicate that EBV regulates lncRNAs which could contribute to tumorigenesis. The findings of this thesis extends the knowledge on the transcriptional regulation by E2 of host cell genes and provide an initial point for the investigation of the impact of E2 on the viral transcriptome., Das Epstein-Barr Virus (EBV) ist das vierthäufigste infektiöse Karzinogen für Menschen. Das Virus etabliert eine lebenslange Latenz in den B-Zellen des Wirts, welche mit verschiedenen B-Zell Tumoren einhergeht. Eine EBV-Infektion von B-Lymphozyten in vitro führt zur Transformation in eine lymphoblastoide Zelllinie (LCL) und deren uneingeschränkten Proliferation. Diese Transformation wird unter anderem von den EBV nuklearen Antigenen (EBNAs) gesteuert. Dazu gehören EBNA2 (E2) und EBNA3A (E3A), zwei ko-exprimierte Transkriptionsfaktoren (TFs), die um die Bindung des DNA-Ankers C-Promotor Binding Factor 1 (CBF1) konkurrieren. Unter deren Zielgenen befinden sich auch mehrere lange, nicht-kodierende RNAs (lncRNAs), wichtige Transkriptionsregulatoren, die mit einer Vielfalt von Krankheiten assoziiert wurden. In dieser Arbeit wurde die E2- und E3A-abhängige Genregulation in einer umfassenden Transkriptomanalyse durch RNA-Seq untersucht, wobei wir uns auf E2 Ziel-Gene, mit besonderem Schwerpunkt auf lncRNAs, fokussiert haben. Unsere Ergebnisse zeigen, dass sich E2- und E3A-regulierte Ziel-Gene genomweit in ko-regulierten Genblöcken (CRGBs) gruppieren. Diese CGRBs bestehen sowohl aus proteinkodierenden als auch aus lncRNA Genen. Ausgewählte Ziel-Gene wurden durch RT-qPCR bestätigt und es konnte zudem gezeigt werden, dass sie während der Etablierung der Latenz nach EBV-Infektion reguliert werden. Mehrere dieser lncRNAs sind bereits aus verschiedenen Krebsarten bekannt. Weiterhin konnten wir hervorheben, dass die Regulation von lncRNAs und dem nächstgelegenen proteinkodierenden Gen positiv korreliert, was für die Regulation von entfernt gelegenen proteinkodierenden Gene durch E2 induzierte lncRNAs spricht. Wir entdeckten, dass E2 sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma in öffentlich zugänglichen Genbanken annotierte lncRNAs reguliert. Zusätzlich haben wir intergenisch (zu ENSEMBL annotierten Genen) transkribierte Gene detektiert, die im Zellkern angereichert waren. Diese sind zum Teil auch noch nicht von der umfassenden lncRNA Datenbank LNCat erfasst und können somit als neu definiert werden. Um direkte E2 Ziel-Gene von denen anderer Transkriptionsfaktoren, die durch E2 induziert werden, zu unterscheiden, haben wir auch E2-regulierte Gene nach Blockade der de novo Proteinsynthese beschrieben. 3 % der E2-Zielgene wurden unter fehlender de novo Proteinsynthese reguliert, einschließlich einiger lncRNAs. Wir fanden, dass 70 % der gemeinsamen Ziel-Gene von E2 und E3A gegenreguliert waren. Schließlich haben wir erste Effekte von E2 und E3A auf das virale Transkriptom untersucht, wo wir eine Induktion lytischer Gene vermuten. In einer unabhängigen Studie konnten wir den Beitrag von Early B Cell Factor 1 (EBF1) zur Chromatin-bindung von E2 an CBF1-unabhängigen Bindungsstellen im humanen Genom funktionell bestätigen. Zusammenfassend zeigen unsere Daten, dass EBV lncRNAs reguliert welche zur Tumorgenese beitragen könnten. Die Ergebnisse dieser Arbeit erweitern das Wissen über die transkriptionelle Regulation von Wirtszellgenen durch E2 und liefern einen Ausgangspunkt für die Untersuchung der Wirkung von E2 auf das virale Transkriptom.
Epstein-Barr virus LCL lncRNA RNA-Seq
Wagner, Simone
2019
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Wagner, Simone (2019): Identification of cellular long non-coding RNAs regulated by the EBV nuclear antigen EBNA2. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Epstein-Barr virus (EBV), the fourth most common infectious carcinogen for humans, can establish a life-long latency in the host B cells, with such latent infection associated with various B cell malignancies. The infection of B lymphocytes by EBV in vitro results in transformation and unlimited proliferation of a so called lymphoblastoide cell line (LCLs). This transformation is driven by EBV nuclear antigens (EBNAs), in addition to other factors. These include EBNA2 (E2) and EBNA3A (E3A), which are co-expressed transcription factors (TFs) competing for binding to a well-studied anchor C promoter binding factor (CBF1). E2 and E3A have been shown to share cellular target genes, including several long non-coding RNAs (lncRNAs). LncRNAs are key transcriptional regulators, associated with a huge variety of diseases including cancer. Herein, we comprehensively assessed the E2 and E3A dependent gene regulation in a transcriptomic analysis by RNA-Seq. We focused on E2 target gene regulation with particular emphasis on known and novel lncRNAs. Our results show that E2 and E3A regulated target genes cluster genome-wide in co-regulated gene blocks (CRGBs). These CRGBs consist of both protein-coding and lncRNA genes. Candidate target genes were confirmed by RT-qPCR and demonstrated to be regulated during the establishment of latency following EBV infection. Several of these lncRNAs were reported to be dysregulated in various cancer types. Further, we demonstrated that the regulation of lncRNAs and the closest protein-coding gene correlates positively, supporting the possibility that E2 induced lncRNAs regulate remote protein-coding genes. We discovered that E2 regulated lncRNAs annotated by public available genome databases in both the nucleus and the cytoplasm. Additionally, we detected intergenic transcribed genes (unannotated by ENSEMBL) enriched in the nucleus. To some extent, these intergenic transcribed genes were not covered by the comprehensive lncRNA database LNCat and can thus be defined as novel. To determine direct E2 target genes and that of other transcription factors induced by E2, we profiled E2 differentially regulated genes with competent and inhibited protein synthesis. 3 % of the E2 target genes were regulated with absent de novo protein synthesis, including several lncRNAs largely emanating from enhancer marked chromatin, indicating that 97% of E2 targets are indirect targets. We found, that up to 70 % of the shared target genes of E2 and E3A were counter-regulated. Finally, we assessed first effects of E2 and E3A on the viral transcriptome finding an induction of lytic genes. In an independent study, we were able to functionally confirm the contribution of early B cell factor 1 EBF1 to chromatin binding of E2 at CBF1 independent binding sites. In conclusion, our data indicate that EBV regulates lncRNAs which could contribute to tumorigenesis. The findings of this thesis extends the knowledge on the transcriptional regulation by E2 of host cell genes and provide an initial point for the investigation of the impact of E2 on the viral transcriptome.

Abstract

Das Epstein-Barr Virus (EBV) ist das vierthäufigste infektiöse Karzinogen für Menschen. Das Virus etabliert eine lebenslange Latenz in den B-Zellen des Wirts, welche mit verschiedenen B-Zell Tumoren einhergeht. Eine EBV-Infektion von B-Lymphozyten in vitro führt zur Transformation in eine lymphoblastoide Zelllinie (LCL) und deren uneingeschränkten Proliferation. Diese Transformation wird unter anderem von den EBV nuklearen Antigenen (EBNAs) gesteuert. Dazu gehören EBNA2 (E2) und EBNA3A (E3A), zwei ko-exprimierte Transkriptionsfaktoren (TFs), die um die Bindung des DNA-Ankers C-Promotor Binding Factor 1 (CBF1) konkurrieren. Unter deren Zielgenen befinden sich auch mehrere lange, nicht-kodierende RNAs (lncRNAs), wichtige Transkriptionsregulatoren, die mit einer Vielfalt von Krankheiten assoziiert wurden. In dieser Arbeit wurde die E2- und E3A-abhängige Genregulation in einer umfassenden Transkriptomanalyse durch RNA-Seq untersucht, wobei wir uns auf E2 Ziel-Gene, mit besonderem Schwerpunkt auf lncRNAs, fokussiert haben. Unsere Ergebnisse zeigen, dass sich E2- und E3A-regulierte Ziel-Gene genomweit in ko-regulierten Genblöcken (CRGBs) gruppieren. Diese CGRBs bestehen sowohl aus proteinkodierenden als auch aus lncRNA Genen. Ausgewählte Ziel-Gene wurden durch RT-qPCR bestätigt und es konnte zudem gezeigt werden, dass sie während der Etablierung der Latenz nach EBV-Infektion reguliert werden. Mehrere dieser lncRNAs sind bereits aus verschiedenen Krebsarten bekannt. Weiterhin konnten wir hervorheben, dass die Regulation von lncRNAs und dem nächstgelegenen proteinkodierenden Gen positiv korreliert, was für die Regulation von entfernt gelegenen proteinkodierenden Gene durch E2 induzierte lncRNAs spricht. Wir entdeckten, dass E2 sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma in öffentlich zugänglichen Genbanken annotierte lncRNAs reguliert. Zusätzlich haben wir intergenisch (zu ENSEMBL annotierten Genen) transkribierte Gene detektiert, die im Zellkern angereichert waren. Diese sind zum Teil auch noch nicht von der umfassenden lncRNA Datenbank LNCat erfasst und können somit als neu definiert werden. Um direkte E2 Ziel-Gene von denen anderer Transkriptionsfaktoren, die durch E2 induziert werden, zu unterscheiden, haben wir auch E2-regulierte Gene nach Blockade der de novo Proteinsynthese beschrieben. 3 % der E2-Zielgene wurden unter fehlender de novo Proteinsynthese reguliert, einschließlich einiger lncRNAs. Wir fanden, dass 70 % der gemeinsamen Ziel-Gene von E2 und E3A gegenreguliert waren. Schließlich haben wir erste Effekte von E2 und E3A auf das virale Transkriptom untersucht, wo wir eine Induktion lytischer Gene vermuten. In einer unabhängigen Studie konnten wir den Beitrag von Early B Cell Factor 1 (EBF1) zur Chromatin-bindung von E2 an CBF1-unabhängigen Bindungsstellen im humanen Genom funktionell bestätigen. Zusammenfassend zeigen unsere Daten, dass EBV lncRNAs reguliert welche zur Tumorgenese beitragen könnten. Die Ergebnisse dieser Arbeit erweitern das Wissen über die transkriptionelle Regulation von Wirtszellgenen durch E2 und liefern einen Ausgangspunkt für die Untersuchung der Wirkung von E2 auf das virale Transkriptom.