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Subcellular localization and dynamics of transmembrane and membrane associated proteins in Corynebacterium glutamicum
Subcellular localization and dynamics of transmembrane and membrane associated proteins in Corynebacterium glutamicum
The cytoplasmic membrane of Corynebacterium glutamicum comprises 660 predicted membrane integral proteins of various functional categories, including transport, signal transduction, protein translocation, proteolysis and energy metabolism. Being an important industrial producer of amino acids, studying the membrane proteome of this organism is relevant for a better understanding of its fundamental processes and possible targeted optimizations. Here, we analyzed the subcellular localization of different transmembrane and membrane-associated proteins of Corynebacterium glutamicum, including the fructose specific PtsF and the glucose specific PtsG transporters, the respiratory chain complex II component SdhA, the small-conductance mechanosensitive channel YggB, and the polar/septa scaffold DivIVA. Using widefield and single molecule localization microscopy, we discovered that PtsG and PtsF form membrane embedded clusters with no defined positions. A similar pattern was observed for SdhA, which curiously, seem to colocalize with PtsF in our widefield microscopy experiments. Size, number and fluorescence of the observed PTS clusters change upon presence or absence of the transported substrate. In presence of the transport substrate, clusters significantly increased in size. Photo-activated localization microscopy (PALM) data revealed that, in presence of different carbon sources, the number of EII proteins per cluster remains the same, however the density of these clusters reduces. Our work reveals a simple mechanism for efficient membrane occupancy regulation. Clusters of PTS EII transporters are densely packed in absence of a suitable substrate. In presence of a transported substrate, the EII proteins in individual clusters occupy larger membrane areas. This mechanism allows for efficient use of the limited membrane space under varying growth conditions without need of protein removal and re-synthesis. Clustering was also observed in YggB, that localized in a punctate pattern of different intensities at the membrane. By changing the NaCl concentration in medium, ranging from 0 mM to 170 mM, we could observe C. glutamicum cells under different degrees of osmotic stress, ranging from hypoosmotic to low hyperosmotic. The extreme studied treatments resulted in impaired growth, which suggests that the cells were indeed under constant osmotic stress. Under such conditions, no changes in YggB-mNeonGreen foci number or fluorescence were observed, hinting that yggB expression is constitutive and that prolonged exposure to osmotic stress does not result in the recruitment of more channels to the membrane. Finally, we studied the dynamics of DivIVA in cells of various shapes, including L-form cells with different morphologies by performing widefield microscopy and fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments with a strain expressing DivIVA-mCherry. DivIVA is a membrane-associated protein that serves as a scaffold for different proteins related to cell division and cell growth. Cell division in bacterial L-forms is unlike the coordinated and precise division observed in cell-walled bacteria. It takes place randomly, not necessarily linked to the divisome and is highly influenced by perturbations in the surrounding environment. Due to this, it is not uncommon to find L-form cells with multiple, parts of, or no chromosomes. Still, in these cells, DivIVA continues to localize in regions of negative curvatures, characterized as bumps in the cytoplasmic membrane. In completely spherical cells, with no regions of higher negative curvature, DivIVA localize as larger foci. Our FRAP results demonstrated that in regions of bumps, the diffusion rate of DivIVA-mCherry is similar to the one observed for poles of rod-shaped cells, but with a significant lower half-time recovery. Furthermore, the diffusion rate on smooth surfaces was more than double, and the half-time recovery less half as the one observed in bumps. This suggests that DivIVA is significantly more mobile in such regions. Moreover, using novel microscopy techniques, the work presented on this thesis shed a light on unexplored facets of membrane protein compartmentalization in Corynebacterium glutamicum., Die Zytoplasmamembran von Corynebacterium glutamicum beherbergt 660 annotierte Membranintegralproteine, die verschiedene Funktionen in Transport, Signaltransduktion, Proteintranslokation, Proteolyse und Energiestoffwechsel wahrnehmen. Da C. glutamicum eine wichtige Rolle in der industriellen Aminosäureproduktion spielt, ist die Untersuchung des Membran-Proteoms wichtig für ein besseres Verständnis grundlegender Prozesse und gezielter Optimierung der Produktionsprozesse. In dieser Arbeit wurde die subzelluläre Lokalisation verschiedener Transmembran- und membranassoziierter Proteine von C. glutamicum analysiert. Dazu gehörten der Fructose-spezifische PtsF- und der Glucose-spezifische PtsG-Transporter, die Komponente SdhA des Komplexes II der Atmungskette, der mechanosensitive Kanal YggB und das am Zellpol lokalisierte Gerüstprotein DivIVA. Unter Verwendung von Weitfeld- und Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie konnte gezeigt werden, dass PtsG und PtsF in Membranen eingebettete Cluster ohne definierte Positionen bilden. Ein ähnliches Muster wurde für SdhA beobachtet, das in Weitfeldmikroskopie-Experimenten interessanterweise mit PtsF zu kolokalisieren scheint. Größe, Anzahl und Fluoreszenz der beobachteten PTS-Cluster änderten sich bei Anwesenheit oder Abwesenheit des transportierten Substrats. In Gegenwart des transportierten Substrats nahm die Größe der Cluster signifikant zu. Daten der photoaktivierbaren Lokalisationsmikroskopie (PALM) ergaben, dass in Gegenwart verschiedener Kohlenstoffquellen die Anzahl der EII-Proteine pro Cluster konstant bleibt, die Dichte dieser Cluster jedoch abnimmt. Diese Arbeit zeigt einen einfachen Mechanismus zur effizienten Regulierung der Membranbelegung. Cluster von PTS-EII-Transportern sind in Abwesenheit eines geeigneten Substrats dicht gepackt. In Gegenwart eines transportierten Substrats besetzen die EII-Proteine in einzelnen Clustern größere Membranflächen. Dieser Mechanismus ermöglicht die effiziente Nutzung des begrenzten Membranraums unter verschiedenen Wachstumsbedingungen, ohne dass Proteine entfernt und erneut synthetisiert werden müssen. Clusterbildung wurde auch bei YggB beobachtet, das in einem punktförmigen Muster unterschiedlicher Intensität an der Membran lokalisiert war. Durch Änderung der NaCl-Konzentration im Medium im Bereich von 0 mM bis 170 mM konnten wir C. glutamicum-Zellen unter osmotischem Stress beobachten, der von hypo- bis leicht hyperosmotisch reichte. Unter Extrembedingungen ließ sich ein negativer Effekt auf das Wachstum beobachten, was darauf hindeutet, dass die Zellen tatsächlich einem konstanten osmotischen Stress ausgesetzt waren. Auch unter solchen Bedingungen wurden keine Änderungen der Anzahl an YggB-mNeonGreen-Foci oder der Fluoreszenz beobachtet, was darauf hindeutet, dass die yggB-Expression konstitutiv ist und dass eine längere Exposition gegenüber osmotischem Stress nicht zur Rekrutierung weiterer YggB-Kanäle an die Membran führt. Schließlich wurde die Dynamik von DivIVA in Zellen verschiedener Formen, einschließlich L-Formen mit unterschiedlichen Morphologien, untersucht. Hierfür wurde ein DivIVA-mCherry-exprimierender Stamm sowohl mittels Weitfeldmikroskopie, als auch mittels Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) analysiert. DivIVA ist ein membranassoziiertes Protein, das als Gerüst für verschiedene Proteine dient, die mit der Zellteilung und dem Zellwachstum zusammenhängen. Die Zellteilung in bakteriellen L-Formen unterscheidet sich von der koordinierten und präzisen Teilung, die bei Bakterien mit Zellwänden beobachtet wird. Sie findet zufällig statt, ist nicht notwendigerweise mit dem Divisom verbunden und wird stark von Störungen in der Umgebung beeinflusst. Aus diesem Grund ist es nicht ungewöhnlich, L-förmige Zellen mit mehreren, oder auch ganz ohne Chromosomen zu finden. Dennoch lokalisiert DivIVA in diesen Zellen weiterhin in Regionen mit negativen Krümmungen, die als „Ausbuchtungen“ in der Zytoplasmamembran zu sehen sind. In vollständig kugelförmigen Zellen ohne Bereiche mit höherer negativer Krümmung lokalisiert DivIVA in größeren Foci. Unsere FRAP-Experimente zeigten, dass die Diffusionsrate von DivIVA-mCherry in Regionen mit hohes Membrankrümmung der von Polen stäbchenförmiger Bakterien ähnelt, jedoch mit signifikant geringerer Halbwertszeit in der Erholungsphase. Unsere Daten zeigen, dass die DivIVA Dynamik von der Zellgeometrie beeinflusst wird. Da DivIVA über die Rekrutierung des Zellwand-Synthese Apparates an der Ausbildung der Zellmorphologie beteiligt ist, stellt dieses System ein einfaches aber effektives Konzept der bakteriellen Selbstorganisation dar. Darüber hinaus war die Diffusionsrate auf wenig gekrümmten Oberflächen mehr als doppelt so hoch und die Halbwertszeit halb so hoch wie die Diffusionsrate in Regionen mit hohes Membrankrümmung. Dies deutet darauf hin, dass DivIVA in solchen Regionen wesentlich mobiler ist. zusammenfassend klären die in dieser Arbeit vorgestellten Daten mithilfe neuartiger Mikroskopietechniken noch nicht erforschte Facetten der Kompartimentierung von Membranproteinen in Corynebacterium glutamicum auf.
C. glutamicum, PTS, Phosphotransferase systems, PtsG, PtsF, YggB, DivIVA
Benevides Martins, Gustavo
2019
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Benevides Martins, Gustavo (2019): Subcellular localization and dynamics of transmembrane and membrane associated proteins in Corynebacterium glutamicum. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

The cytoplasmic membrane of Corynebacterium glutamicum comprises 660 predicted membrane integral proteins of various functional categories, including transport, signal transduction, protein translocation, proteolysis and energy metabolism. Being an important industrial producer of amino acids, studying the membrane proteome of this organism is relevant for a better understanding of its fundamental processes and possible targeted optimizations. Here, we analyzed the subcellular localization of different transmembrane and membrane-associated proteins of Corynebacterium glutamicum, including the fructose specific PtsF and the glucose specific PtsG transporters, the respiratory chain complex II component SdhA, the small-conductance mechanosensitive channel YggB, and the polar/septa scaffold DivIVA. Using widefield and single molecule localization microscopy, we discovered that PtsG and PtsF form membrane embedded clusters with no defined positions. A similar pattern was observed for SdhA, which curiously, seem to colocalize with PtsF in our widefield microscopy experiments. Size, number and fluorescence of the observed PTS clusters change upon presence or absence of the transported substrate. In presence of the transport substrate, clusters significantly increased in size. Photo-activated localization microscopy (PALM) data revealed that, in presence of different carbon sources, the number of EII proteins per cluster remains the same, however the density of these clusters reduces. Our work reveals a simple mechanism for efficient membrane occupancy regulation. Clusters of PTS EII transporters are densely packed in absence of a suitable substrate. In presence of a transported substrate, the EII proteins in individual clusters occupy larger membrane areas. This mechanism allows for efficient use of the limited membrane space under varying growth conditions without need of protein removal and re-synthesis. Clustering was also observed in YggB, that localized in a punctate pattern of different intensities at the membrane. By changing the NaCl concentration in medium, ranging from 0 mM to 170 mM, we could observe C. glutamicum cells under different degrees of osmotic stress, ranging from hypoosmotic to low hyperosmotic. The extreme studied treatments resulted in impaired growth, which suggests that the cells were indeed under constant osmotic stress. Under such conditions, no changes in YggB-mNeonGreen foci number or fluorescence were observed, hinting that yggB expression is constitutive and that prolonged exposure to osmotic stress does not result in the recruitment of more channels to the membrane. Finally, we studied the dynamics of DivIVA in cells of various shapes, including L-form cells with different morphologies by performing widefield microscopy and fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments with a strain expressing DivIVA-mCherry. DivIVA is a membrane-associated protein that serves as a scaffold for different proteins related to cell division and cell growth. Cell division in bacterial L-forms is unlike the coordinated and precise division observed in cell-walled bacteria. It takes place randomly, not necessarily linked to the divisome and is highly influenced by perturbations in the surrounding environment. Due to this, it is not uncommon to find L-form cells with multiple, parts of, or no chromosomes. Still, in these cells, DivIVA continues to localize in regions of negative curvatures, characterized as bumps in the cytoplasmic membrane. In completely spherical cells, with no regions of higher negative curvature, DivIVA localize as larger foci. Our FRAP results demonstrated that in regions of bumps, the diffusion rate of DivIVA-mCherry is similar to the one observed for poles of rod-shaped cells, but with a significant lower half-time recovery. Furthermore, the diffusion rate on smooth surfaces was more than double, and the half-time recovery less half as the one observed in bumps. This suggests that DivIVA is significantly more mobile in such regions. Moreover, using novel microscopy techniques, the work presented on this thesis shed a light on unexplored facets of membrane protein compartmentalization in Corynebacterium glutamicum.

Abstract

Die Zytoplasmamembran von Corynebacterium glutamicum beherbergt 660 annotierte Membranintegralproteine, die verschiedene Funktionen in Transport, Signaltransduktion, Proteintranslokation, Proteolyse und Energiestoffwechsel wahrnehmen. Da C. glutamicum eine wichtige Rolle in der industriellen Aminosäureproduktion spielt, ist die Untersuchung des Membran-Proteoms wichtig für ein besseres Verständnis grundlegender Prozesse und gezielter Optimierung der Produktionsprozesse. In dieser Arbeit wurde die subzelluläre Lokalisation verschiedener Transmembran- und membranassoziierter Proteine von C. glutamicum analysiert. Dazu gehörten der Fructose-spezifische PtsF- und der Glucose-spezifische PtsG-Transporter, die Komponente SdhA des Komplexes II der Atmungskette, der mechanosensitive Kanal YggB und das am Zellpol lokalisierte Gerüstprotein DivIVA. Unter Verwendung von Weitfeld- und Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie konnte gezeigt werden, dass PtsG und PtsF in Membranen eingebettete Cluster ohne definierte Positionen bilden. Ein ähnliches Muster wurde für SdhA beobachtet, das in Weitfeldmikroskopie-Experimenten interessanterweise mit PtsF zu kolokalisieren scheint. Größe, Anzahl und Fluoreszenz der beobachteten PTS-Cluster änderten sich bei Anwesenheit oder Abwesenheit des transportierten Substrats. In Gegenwart des transportierten Substrats nahm die Größe der Cluster signifikant zu. Daten der photoaktivierbaren Lokalisationsmikroskopie (PALM) ergaben, dass in Gegenwart verschiedener Kohlenstoffquellen die Anzahl der EII-Proteine pro Cluster konstant bleibt, die Dichte dieser Cluster jedoch abnimmt. Diese Arbeit zeigt einen einfachen Mechanismus zur effizienten Regulierung der Membranbelegung. Cluster von PTS-EII-Transportern sind in Abwesenheit eines geeigneten Substrats dicht gepackt. In Gegenwart eines transportierten Substrats besetzen die EII-Proteine in einzelnen Clustern größere Membranflächen. Dieser Mechanismus ermöglicht die effiziente Nutzung des begrenzten Membranraums unter verschiedenen Wachstumsbedingungen, ohne dass Proteine entfernt und erneut synthetisiert werden müssen. Clusterbildung wurde auch bei YggB beobachtet, das in einem punktförmigen Muster unterschiedlicher Intensität an der Membran lokalisiert war. Durch Änderung der NaCl-Konzentration im Medium im Bereich von 0 mM bis 170 mM konnten wir C. glutamicum-Zellen unter osmotischem Stress beobachten, der von hypo- bis leicht hyperosmotisch reichte. Unter Extrembedingungen ließ sich ein negativer Effekt auf das Wachstum beobachten, was darauf hindeutet, dass die Zellen tatsächlich einem konstanten osmotischen Stress ausgesetzt waren. Auch unter solchen Bedingungen wurden keine Änderungen der Anzahl an YggB-mNeonGreen-Foci oder der Fluoreszenz beobachtet, was darauf hindeutet, dass die yggB-Expression konstitutiv ist und dass eine längere Exposition gegenüber osmotischem Stress nicht zur Rekrutierung weiterer YggB-Kanäle an die Membran führt. Schließlich wurde die Dynamik von DivIVA in Zellen verschiedener Formen, einschließlich L-Formen mit unterschiedlichen Morphologien, untersucht. Hierfür wurde ein DivIVA-mCherry-exprimierender Stamm sowohl mittels Weitfeldmikroskopie, als auch mittels Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) analysiert. DivIVA ist ein membranassoziiertes Protein, das als Gerüst für verschiedene Proteine dient, die mit der Zellteilung und dem Zellwachstum zusammenhängen. Die Zellteilung in bakteriellen L-Formen unterscheidet sich von der koordinierten und präzisen Teilung, die bei Bakterien mit Zellwänden beobachtet wird. Sie findet zufällig statt, ist nicht notwendigerweise mit dem Divisom verbunden und wird stark von Störungen in der Umgebung beeinflusst. Aus diesem Grund ist es nicht ungewöhnlich, L-förmige Zellen mit mehreren, oder auch ganz ohne Chromosomen zu finden. Dennoch lokalisiert DivIVA in diesen Zellen weiterhin in Regionen mit negativen Krümmungen, die als „Ausbuchtungen“ in der Zytoplasmamembran zu sehen sind. In vollständig kugelförmigen Zellen ohne Bereiche mit höherer negativer Krümmung lokalisiert DivIVA in größeren Foci. Unsere FRAP-Experimente zeigten, dass die Diffusionsrate von DivIVA-mCherry in Regionen mit hohes Membrankrümmung der von Polen stäbchenförmiger Bakterien ähnelt, jedoch mit signifikant geringerer Halbwertszeit in der Erholungsphase. Unsere Daten zeigen, dass die DivIVA Dynamik von der Zellgeometrie beeinflusst wird. Da DivIVA über die Rekrutierung des Zellwand-Synthese Apparates an der Ausbildung der Zellmorphologie beteiligt ist, stellt dieses System ein einfaches aber effektives Konzept der bakteriellen Selbstorganisation dar. Darüber hinaus war die Diffusionsrate auf wenig gekrümmten Oberflächen mehr als doppelt so hoch und die Halbwertszeit halb so hoch wie die Diffusionsrate in Regionen mit hohes Membrankrümmung. Dies deutet darauf hin, dass DivIVA in solchen Regionen wesentlich mobiler ist. zusammenfassend klären die in dieser Arbeit vorgestellten Daten mithilfe neuartiger Mikroskopietechniken noch nicht erforschte Facetten der Kompartimentierung von Membranproteinen in Corynebacterium glutamicum auf.