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Mechanics of the streptavidin/biotin interaction
Mechanics of the streptavidin/biotin interaction
The homotetrameric protein streptavidin (SA) binds the small molecule biotin with an extraordinarily high affinity. Their interaction is specific, long-lived and robust under a wide range of conditions. Biotin can readily be attached to proteins, nucleic acids or nanoparticles. This receptor-ligand system has thus found wide application in biotechnology, nanotechnology and medicine. Many modern diagnostic techniques, such as immunoassays, rely on the stable interaction of SA and biotin. In biophysics, the SA/biotin interaction serves as a popular anchoring tool to immobilize molecules or cells for force spectroscopy experiments using optical or magnetic tweezers, acoustic or atomic force microscopy. Within the last 25 years, a lot of effort has been put into understanding the mechanical stability of the tight binding of biotin to SA. Contradictory results on the response of the receptor-ligand complex, when forcibly separated, have been published. In this thesis, biomolecular protein engineering methods were applied to design and prepare customized SA constructs with defined stoichiometry and handles enabling covalent, site-specific immobilization and labeling for single-molecule or bulk assays. Using tools from nanotechnology to manipulate proteins on the single-molecule level, the mechanical properties of the receptor-ligand interaction between SA and biotin were investigated. Steered molecular dynamics simulations complemented the experiments to shed light on the underlying molecular processes. The development of monovalent SA made it possible to investigate the unbinding of biotin from a single SA subunit in a controlled manner: Probing monovalent SA by atomic force microscopy-based single-molecule force spectroscopy in a well-defined tethering geometry, a relatively narrow distribution of unbinding forces (compared with previous studies) was observed. Tethering monovalent SA by the C- or N-terminus of its functional subunit, it was demonstrated how different force-loading geometries influence unbinding forces. Steered molecular dynamics simulations helped to reveal an unbinding pathway that involves partial unfolding of SA’s functional subunit. Taking advantage of the difference in unbinding forces, a force hierarchy was created that allowed to manipulate single molecules with the cantilever tip of the atomic force microscope to create nanoscale arrangements of proteins on a surface. In the future, this can be used to investigate enzyme networks on the single molecule level in arbitrary arrangements. The study was finally extended from monovalent to tetravalent SA. Although the four biotin binding pockets of SA are thermodynamically equal, the subunits behave differently when force is applied: Tethering one of the subunits C-terminally and pulling on one of the biotin molecules, SA’s symmetry is broken and the maximum restoring force, which builds up before the complex ruptures, is significantly different for the four subunits. With the help of steered molecular dynamics simulations, it was demonstrated that depending on the tethering geometry, biotin and the adjacent linker molecules get pushed against a flexible part of the binding pocket. This induces a conformational change in the binding pocket, impedes its structural integrity and significantly decreases biotin’s unbinding force. These results were confirmed in constant force experiments using magnetic tweezers. The significant difference in bond lifetime for the different tethering geometries is of interest when aiming for particularly long-lived interactions in any assay in which forces (e.g. shear or tensile forces) act on the SA/biotin bond. The insights into the mechanical stability of the SA/biotin interaction that were gained in this work have contributed to understand and to reconcile the contradictory results of previous publications: For different force-loading geometries, significantly different unbinding forces can be measured for the same receptor-ligand system. With the results of this work, it could further be concluded that in the context of ligand dissociation under force, unfolding and unbinding can be intertwined: It is altogether possible that a receptor is partially unfolded before the binding to the ligand gives in. Beyond that, it was shown that if SA is anchored in a disadvantageous geometry, force-induced conformational changes of the binding pocket can occur, resulting in a substantial weakening of the binding. The better understanding of the mechanical stability of the SA/biotin system guides the way to use robust and stable tethering geometries of SA in force spectroscopy measurements. In the future, the results of this work can contribute to modify certain characteristics of SA by protein engineering to further optimize this extraordinary protein for specific applications., Das Protein Streptavidin bindet das kleine Molekül Biotin mit außerordentlich hoher Affinität. Die Interaktion ist spezifisch, langlebig und robust unter verschiedensten Bedingungen. Biotin kann recht einfach an Proteine, Nukleinsäuren oder Nanopartikel gekoppelt werden. Darum wird dieses Rezeptor-Liganden-System für vielzählige Anwendungen in der Biotechnologie, Nanotechnologie und Medizin verwendet. Viele moderne diagnostische Verfahren, wie zum Beispiel Immunoassays, sind auf die stabile Interaktion zwischen Streptavidin und Biotin angewiesen. In der Biophysik dient die Streptavidin/Biotin-Interaktion als molekulares Verankerungssystem, um Moleküle oder Zellen für kraftspektroskopische Untersuchungen (mit optischen oder magnetischen Pinzetten, akustischer oder atomarer Kraftmikroskopie) zu immobilisieren. In den letzten 25 Jahren sind sehr viele Anstrengungen unternommen worden, um die mechanische Stabilität der engen Bindung von Biotin an Streptavidin zu verstehen. Hinsichtlich der Reaktion des Rezeptor-Liganden-Komplexes auf Trennung durch äußere Kräfte sind widersprüchliche Ergebnisse publiziert worden. In der vorliegenden Arbeit wurden biomolekulare Protein-Engineering-Methoden verwendet, um individuell angepasste Streptavidinkonstrukte mit definierter Stöchiometrie und Markierungen für eine kontrollierte kovalente Anbindung herzustellen. Mit nanotechnologischen Instrumenten und Methoden, um einzelne Moleküle zu manipulieren, wurden die mechanischen Eigenschaften der Interaktion zwischen Streptavidin und Biotin untersucht. Die Experimente wurden durch Molekulardynamiksimulationen ergänzt, um auch die zu Grunde liegenden molekularen Prozesse zu beleuchten. Die Verwendung von monovalentem Streptavidin ermöglichte es, das Entbinden von Biotin von einer einzelnen Streptavidinuntereinheit in einer kontrollierten Weise zu messen. Bei Untersuchungen von monovalentem Streptavidin mit Rasterkraftmikroskopie-basierter Einzelmolekülkraftspektroskopie in einer definierten Anbindungsgeometrie wurde eine im Vergleich zu früheren Studien verhältnismäßig schmale Verteilung von Entbindungskräften gemessen. Durch die Verwendung von C- beziehungsweise N-terminal angebundenem monovalentem Streptavidin in Kraftspektroskopieexperimenten wurde außerdem gezeigt, wie verschiedene Kraftladungsgeometrien Entbindungskräfte beeinflussen. Molekulardynamiksimulationen trugen dazu bei, einen Entbindungsweg aufzudecken, der eine partielle Entfaltung der funktionalen Untereinheit von Streptavidin beinhaltet. Die unterschiedlichen Entbindungskräfte für die verschiedenen Anbindungsgeometrien wurden ausgenutzt, um eine Krafthierarchie zu schaffen, die es erlaubt, einzelne Moleküle mithilfe der Spitze des Federbalkens des Rasterkraftmikroskops zu manipulieren, um Proteine in definierten Strukturen im Nanometerbereich auf einer Oberfläche anzuordnen. Dies kann in der Zukunft dafür verwendet werden, Enzymnetzwerke auf Einzelmolekülebene in beliebigen Anordnungen zu untersuchen. Die Experimente wurden schließlich von monovalentem auf tetravalentes Streptavidin ausgeweitet. Es wurde entdeckt, dass sich die vier Biotin-Bindungstaschen von Streptavidin unter Kraft verschieden verhalten, obwohl sie thermodynamisch gleich sind: Wenn man eine Untereinheit an ihrem C-Terminus befestigt und ein Biotin aus einer der Bindungstaschen zieht, ist die Symmetrie zwischen den Untereinheiten gebrochen und die maximale Rückstellkraft, die sich im Proteinkomplex aufbaut, bevor dieser nachgibt, ist für die verschiedenen Bindungstaschen signifikant verschieden. Mithilfe von Molekulardynamiksimulationen konnte gezeigt werden, dass unter Kraft – je nach Anbindungsgeometrie – Biotin und anschließende molekulare Linker gegen einen flexiblen Teil der Bindungstasche drücken. Dies führt zu einer kraftinduzierten Konformationsänderung der Bindungstasche, beeinträchtigt ihre strukturelle Integrität und mindert die Entbindungskraft. von Biotin erheblich. Diese Ergebnisse konnten in Experimenten mit konstanter Kraft in magnetischen Pinzetten bestätigt werden. Dieser deutliche Lebensdauerunterschied der Bindung für verschiedene Anbindungsgeometrien ist von Interesse, wenn man eine besonders langlebige Anbindung von Molekülen in einem Analyseverfahren benötigt, bei dem äußere Kräfte (sowohl Zug- als auch Scherkräfte) auf diese wirken. Die Einblicke, die im Rahmen dieser Arbeit in die mechanische Stabilität der Streptavidin-Biotin-Interaktion gewonnen wurden, haben dazu beigetragen, die früheren Widersprüche zwischen verschiedenen Publikationen zu verstehen und miteinander in Einklang zu bringen: Für verschiedene Kraftladungsgeometrien können für dasselbe Rezeptor-Liganden-System erheblich unterschiedliche Entbindungskräfte gemessen werden. Durch die Ergebnisse dieser Arbeit konnte außerdem gefolgert werden, dass es enge Verflechtungen von Entfaltung und Entbindung im Bezug auf Ligandendissoziation unter Kraft geben kann: Es ist durchaus möglich, dass ein Rezeptor zunächst teilweise entfaltet wird, bevor die Bindung zum Liganden nachgibt. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass kraftinduzierte Konformationsänderungen der Bindungstasche, die in einer Schwächung der Bindung resultieren, auftreten können, wenn Streptavidin in einer unvorteilhaften Anbindungsgeometrie verwendet wird. Das bessere Verständnis der mechanischen Stabilität des Biotin-Streptavidin-Systems dient nun als Wegweiser, robuste und unter Kraft stabile Anbindungsgeometrien für Streptavidin in Kraftspektroskopiemessungen zu verwenden. Die Ergebnisse dieser Arbeit können in Zukunft dazu beitragen, Eigenschaften von Streptavidin mit Protein-Engineering-Methoden für bestimmte Anwendungen besser anzupassen und weiter zu optimieren.
Biophysics, Single Molecule Force Spectroscopy, Atomic Force Microscopy, Protein Engineering, Streptavidin, Biotin
Sedlak, Steffen Matthias
2019
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Sedlak, Steffen Matthias (2019): Mechanics of the streptavidin/biotin interaction. Dissertation, LMU München: Faculty of Physics
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Abstract

The homotetrameric protein streptavidin (SA) binds the small molecule biotin with an extraordinarily high affinity. Their interaction is specific, long-lived and robust under a wide range of conditions. Biotin can readily be attached to proteins, nucleic acids or nanoparticles. This receptor-ligand system has thus found wide application in biotechnology, nanotechnology and medicine. Many modern diagnostic techniques, such as immunoassays, rely on the stable interaction of SA and biotin. In biophysics, the SA/biotin interaction serves as a popular anchoring tool to immobilize molecules or cells for force spectroscopy experiments using optical or magnetic tweezers, acoustic or atomic force microscopy. Within the last 25 years, a lot of effort has been put into understanding the mechanical stability of the tight binding of biotin to SA. Contradictory results on the response of the receptor-ligand complex, when forcibly separated, have been published. In this thesis, biomolecular protein engineering methods were applied to design and prepare customized SA constructs with defined stoichiometry and handles enabling covalent, site-specific immobilization and labeling for single-molecule or bulk assays. Using tools from nanotechnology to manipulate proteins on the single-molecule level, the mechanical properties of the receptor-ligand interaction between SA and biotin were investigated. Steered molecular dynamics simulations complemented the experiments to shed light on the underlying molecular processes. The development of monovalent SA made it possible to investigate the unbinding of biotin from a single SA subunit in a controlled manner: Probing monovalent SA by atomic force microscopy-based single-molecule force spectroscopy in a well-defined tethering geometry, a relatively narrow distribution of unbinding forces (compared with previous studies) was observed. Tethering monovalent SA by the C- or N-terminus of its functional subunit, it was demonstrated how different force-loading geometries influence unbinding forces. Steered molecular dynamics simulations helped to reveal an unbinding pathway that involves partial unfolding of SA’s functional subunit. Taking advantage of the difference in unbinding forces, a force hierarchy was created that allowed to manipulate single molecules with the cantilever tip of the atomic force microscope to create nanoscale arrangements of proteins on a surface. In the future, this can be used to investigate enzyme networks on the single molecule level in arbitrary arrangements. The study was finally extended from monovalent to tetravalent SA. Although the four biotin binding pockets of SA are thermodynamically equal, the subunits behave differently when force is applied: Tethering one of the subunits C-terminally and pulling on one of the biotin molecules, SA’s symmetry is broken and the maximum restoring force, which builds up before the complex ruptures, is significantly different for the four subunits. With the help of steered molecular dynamics simulations, it was demonstrated that depending on the tethering geometry, biotin and the adjacent linker molecules get pushed against a flexible part of the binding pocket. This induces a conformational change in the binding pocket, impedes its structural integrity and significantly decreases biotin’s unbinding force. These results were confirmed in constant force experiments using magnetic tweezers. The significant difference in bond lifetime for the different tethering geometries is of interest when aiming for particularly long-lived interactions in any assay in which forces (e.g. shear or tensile forces) act on the SA/biotin bond. The insights into the mechanical stability of the SA/biotin interaction that were gained in this work have contributed to understand and to reconcile the contradictory results of previous publications: For different force-loading geometries, significantly different unbinding forces can be measured for the same receptor-ligand system. With the results of this work, it could further be concluded that in the context of ligand dissociation under force, unfolding and unbinding can be intertwined: It is altogether possible that a receptor is partially unfolded before the binding to the ligand gives in. Beyond that, it was shown that if SA is anchored in a disadvantageous geometry, force-induced conformational changes of the binding pocket can occur, resulting in a substantial weakening of the binding. The better understanding of the mechanical stability of the SA/biotin system guides the way to use robust and stable tethering geometries of SA in force spectroscopy measurements. In the future, the results of this work can contribute to modify certain characteristics of SA by protein engineering to further optimize this extraordinary protein for specific applications.

Abstract

Das Protein Streptavidin bindet das kleine Molekül Biotin mit außerordentlich hoher Affinität. Die Interaktion ist spezifisch, langlebig und robust unter verschiedensten Bedingungen. Biotin kann recht einfach an Proteine, Nukleinsäuren oder Nanopartikel gekoppelt werden. Darum wird dieses Rezeptor-Liganden-System für vielzählige Anwendungen in der Biotechnologie, Nanotechnologie und Medizin verwendet. Viele moderne diagnostische Verfahren, wie zum Beispiel Immunoassays, sind auf die stabile Interaktion zwischen Streptavidin und Biotin angewiesen. In der Biophysik dient die Streptavidin/Biotin-Interaktion als molekulares Verankerungssystem, um Moleküle oder Zellen für kraftspektroskopische Untersuchungen (mit optischen oder magnetischen Pinzetten, akustischer oder atomarer Kraftmikroskopie) zu immobilisieren. In den letzten 25 Jahren sind sehr viele Anstrengungen unternommen worden, um die mechanische Stabilität der engen Bindung von Biotin an Streptavidin zu verstehen. Hinsichtlich der Reaktion des Rezeptor-Liganden-Komplexes auf Trennung durch äußere Kräfte sind widersprüchliche Ergebnisse publiziert worden. In der vorliegenden Arbeit wurden biomolekulare Protein-Engineering-Methoden verwendet, um individuell angepasste Streptavidinkonstrukte mit definierter Stöchiometrie und Markierungen für eine kontrollierte kovalente Anbindung herzustellen. Mit nanotechnologischen Instrumenten und Methoden, um einzelne Moleküle zu manipulieren, wurden die mechanischen Eigenschaften der Interaktion zwischen Streptavidin und Biotin untersucht. Die Experimente wurden durch Molekulardynamiksimulationen ergänzt, um auch die zu Grunde liegenden molekularen Prozesse zu beleuchten. Die Verwendung von monovalentem Streptavidin ermöglichte es, das Entbinden von Biotin von einer einzelnen Streptavidinuntereinheit in einer kontrollierten Weise zu messen. Bei Untersuchungen von monovalentem Streptavidin mit Rasterkraftmikroskopie-basierter Einzelmolekülkraftspektroskopie in einer definierten Anbindungsgeometrie wurde eine im Vergleich zu früheren Studien verhältnismäßig schmale Verteilung von Entbindungskräften gemessen. Durch die Verwendung von C- beziehungsweise N-terminal angebundenem monovalentem Streptavidin in Kraftspektroskopieexperimenten wurde außerdem gezeigt, wie verschiedene Kraftladungsgeometrien Entbindungskräfte beeinflussen. Molekulardynamiksimulationen trugen dazu bei, einen Entbindungsweg aufzudecken, der eine partielle Entfaltung der funktionalen Untereinheit von Streptavidin beinhaltet. Die unterschiedlichen Entbindungskräfte für die verschiedenen Anbindungsgeometrien wurden ausgenutzt, um eine Krafthierarchie zu schaffen, die es erlaubt, einzelne Moleküle mithilfe der Spitze des Federbalkens des Rasterkraftmikroskops zu manipulieren, um Proteine in definierten Strukturen im Nanometerbereich auf einer Oberfläche anzuordnen. Dies kann in der Zukunft dafür verwendet werden, Enzymnetzwerke auf Einzelmolekülebene in beliebigen Anordnungen zu untersuchen. Die Experimente wurden schließlich von monovalentem auf tetravalentes Streptavidin ausgeweitet. Es wurde entdeckt, dass sich die vier Biotin-Bindungstaschen von Streptavidin unter Kraft verschieden verhalten, obwohl sie thermodynamisch gleich sind: Wenn man eine Untereinheit an ihrem C-Terminus befestigt und ein Biotin aus einer der Bindungstaschen zieht, ist die Symmetrie zwischen den Untereinheiten gebrochen und die maximale Rückstellkraft, die sich im Proteinkomplex aufbaut, bevor dieser nachgibt, ist für die verschiedenen Bindungstaschen signifikant verschieden. Mithilfe von Molekulardynamiksimulationen konnte gezeigt werden, dass unter Kraft – je nach Anbindungsgeometrie – Biotin und anschließende molekulare Linker gegen einen flexiblen Teil der Bindungstasche drücken. Dies führt zu einer kraftinduzierten Konformationsänderung der Bindungstasche, beeinträchtigt ihre strukturelle Integrität und mindert die Entbindungskraft. von Biotin erheblich. Diese Ergebnisse konnten in Experimenten mit konstanter Kraft in magnetischen Pinzetten bestätigt werden. Dieser deutliche Lebensdauerunterschied der Bindung für verschiedene Anbindungsgeometrien ist von Interesse, wenn man eine besonders langlebige Anbindung von Molekülen in einem Analyseverfahren benötigt, bei dem äußere Kräfte (sowohl Zug- als auch Scherkräfte) auf diese wirken. Die Einblicke, die im Rahmen dieser Arbeit in die mechanische Stabilität der Streptavidin-Biotin-Interaktion gewonnen wurden, haben dazu beigetragen, die früheren Widersprüche zwischen verschiedenen Publikationen zu verstehen und miteinander in Einklang zu bringen: Für verschiedene Kraftladungsgeometrien können für dasselbe Rezeptor-Liganden-System erheblich unterschiedliche Entbindungskräfte gemessen werden. Durch die Ergebnisse dieser Arbeit konnte außerdem gefolgert werden, dass es enge Verflechtungen von Entfaltung und Entbindung im Bezug auf Ligandendissoziation unter Kraft geben kann: Es ist durchaus möglich, dass ein Rezeptor zunächst teilweise entfaltet wird, bevor die Bindung zum Liganden nachgibt. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass kraftinduzierte Konformationsänderungen der Bindungstasche, die in einer Schwächung der Bindung resultieren, auftreten können, wenn Streptavidin in einer unvorteilhaften Anbindungsgeometrie verwendet wird. Das bessere Verständnis der mechanischen Stabilität des Biotin-Streptavidin-Systems dient nun als Wegweiser, robuste und unter Kraft stabile Anbindungsgeometrien für Streptavidin in Kraftspektroskopiemessungen zu verwenden. Die Ergebnisse dieser Arbeit können in Zukunft dazu beitragen, Eigenschaften von Streptavidin mit Protein-Engineering-Methoden für bestimmte Anwendungen besser anzupassen und weiter zu optimieren.